ESCUELA POLITÉCNICA DEL EJÉRCITO DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA DETERMINACIÓN DE LA PREVALENCIA DE ANAPLASMOSIS EN EL GANADO BOVINO FAENADO EN LA EMPRESA METROPOLITANA DE RASTRO DE QUITO (EMRQ) MEDIANTE LA APLICACIÓN DE LAS TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO: MICROSCOPÍA DE FROTIS SANGUÍNEOS, REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) Y ENSAYO INMUNOENZIMÁTICO COMPETITIVO (cELISA) Previa a la obtención de Grado Académico o Título de: INGENIERA EN BIOTECNOLOGÍA ELABORADO POR: KARLA KATHERINE SOTO RAMIREZ Sangolquí, 30 de Noviembre de 2010 ii LEGALIZACIÓN DEL PROYECTO ELABORADO POR _________________________________ KARLA KATHERINE SOTO RAMIREZ COORDINADOR DE LA CARRERA DE INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA ____________________________ Ing. Rafael Vargas SECRETARIO ACADÉMICO ___________________________________ Abg. Vanessa Andrade Sangolquí, 30 de Noviembre de 2010 iii CERTIFICACIÓN Dra. María Augusta Chávez Dr. Freddy Proaño Certifican: Que el trabajo titulado “DETERMINACIÓN DE LA PREVALENCIA DE ANAPLASMOSIS EN EL GANADO BOVINO FAENADO EN LA EMPRESA METROPOLITANA DE RASTRO DE QUITO (EMRQ) MEDIANTE LA APLICACIÓN DE LAS TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO: MICROSCOPÍA DE FROTIS SANGUÍNEOS, REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) Y ENSAYO INMUNOENZIMÁTICO COMPETITIVO (cELISA)”, realizado por Karla Katherine Soto Ramírez, ha sido guiado y revisado periódicamente y cumple normas estatutarias establecidas por la ESPE, en el Reglamento de Estudiantes de la Escuela Politécnica del Ejército. El mencionado trabajo consta de un documento empastado y un disco compacto el cual contiene los archivos en formato portátil de Acrobat (pdf). Autorizan a Karla Katherine Soto Ramírez que lo entregue a Ing. Rafael Vargas, en su calidad de Coordinador de la Carrera. Sangolquí, 30 de Noviembre de 2010 __________________________ ___________________________ Dra. María Augusta Chávez Dr. Freddy Proaño DIRECTOR CODIRECTOR iv DECLARACION DE RESPONSABILIDAD Karla Katherine Soto Ramírez Declaro que: El proyecto de grado denominado “DETERMINACIÓN DE LA PREVALENCIA DE ANAPLASMOSIS EN EL GANADO BOVINO FAENADO EN LA EMPRESA METROPOLITANA DE RASTRO DE QUITO (EMRQ) MEDIANTE LA APLICACIÓN DE LAS TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO: MICROSCOPÍA DE FROTIS SANGUÍNEOS, REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) Y ENSAYO INMUNOENZIMÁTICO COMPETITIVO (cELISA)”, ha sido desarrollado con base a una investigación exhaustiva, respetando derechos intelectuales de terceros, conforme las citas que constan al pie de las páginas correspondientes, cuyas fuentes se incorporan en la bibliografía. Consecuentemente este trabajo es de mí autoría. En virtud de esta declaración, me responsabilizo del contenido, veracidad y alcance científico del proyecto de grado en mención. Sangolquí, 30 de Noviembre de 2010 ___________________________ Karla Katherine Soto Ramírez v AUTORIZACIÓN Yo, Karla Katherine Soto Ramírez Autorizo a la Escuela Politécnica del Ejército la publicación, en la biblioteca virtual de la Institución del trabajo “DETERMINACIÓN DE LA PREVALENCIA DE ANAPLASMOSIS EN EL GANADO BOVINO FAENADO EN LA EMPRESA METROPOLITANA DE RASTRO DE QUITO (EMRQ) MEDIANTE LA APLICACIÓN DE LAS TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO: MICROSCOPÍA DE FROTIS SANGUÍNEOS, REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) Y ENSAYO INMUNOENZIMÁTICO COMPETITIVO (cELISA)”, cuyo contenido, ideas y criterios son de mi exclusiva responsabilidad y autoría. Sangolquí, 30 de Noviembre del 2010 ___________________________ Karla Katherine Soto Ramírez vi DEDICATORIA A mi madre, Maricela Ramírez por su apoyo incondicional. A mis hermanos Gregory y Marco, por su cariño y su constante estímulo para mi superación personal. KARLA KATHERINE SOTO RAMÍREZ vii AGRADECIMIENTOS Dra. María Augusta Chávez y Dr. Freddy Proaño por su guía y ayuda en la realización de mi tesis. Dr. Armando Reyna por su apoyo científico, consejos en la realización de mi tesis y por proporcionarme el ADN control de Anaplasma marginale. Dr. Marcelo Grijalva por su asesoramiento en la técnica de PCR Ing. Pedro Romero por orientarme al realizar los datos estadísticos de mi tesis. Dr. Jorge Ron por su ayuda y guía en la presentación de los resultados. Al Laboratorio de Biotecnología Humana ESPE, en especial a Ing. Oderay Andrade y Gabriela Granja por ayuda y consejos en el laboratorio. A las personas que trabajan en el Empresa Metropolitana de Rastro de Quito por su cooperación al realizar la toma de muestras de está investigación, en especial al Dr. Ramiro González. A los laboratorios Zurita&Zurita por prestar sus instalaciones para realizar la técnica cELISA. A mis amigos, María José Anrango, Cristian Cando, David Dávila, María Fernanda Guevara, Fernanda Jiménez, Elizabeth Minda, Anita Tito y Paulina Quijia por sus palabras y apoyo incondicional. KARLA KATHERINE SOTO RAMÍREZ viii ÍNDICE DE CONTENIDOS LEGALIZACIÓN DEL PROYECTO ....................................................................................................... ii CERTIFICACIÓN .............................................................................................................................. iii DECLARACION DE RESPONSABILIDAD ............................................................................................. iv AUTORIZACIÓN ...............................................................................................................................v DEDICATORIA ................................................................................................................................. vi AGRADECIMIENTOS ...................................................................................................................... vii ÍNDICE DE CONTENIDOS ............................................................................................................... viii LISTADO DE TABLAS ...................................................................................................................... xii LISTADO DE CUADROS ................................................................................................................. xiii LISTADO DE FIGURAS ................................................................................................................... xiv LISTADO DE ANEXOS .................................................................................................................... xvi RESUMEN ................................................................................................................................... xvii ABSTRACT .................................................................................................................................. xviii CAPÍTULO 1: INTRODUCCIÓN .............................................................................................. 1 1.1 FORMULACIÓN DEL PROBLEMA ................................................................................................ 1 1.2 JUSTIFICACIÓN DEL PROBLEMA ................................................................................................. 1 1.3 OBJETIVOS DE LA INVESTIGACIÓN .............................................................................................. 2 1.3.1 OBJETIVO GENERAL ................................................................................................................. 2 1.3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ........................................................................................................... 3 1.4 MARCO TEÓRICO .................................................................................................................. 3 1.4.1 ANAPLASMOSIS ...................................................................................................................... 3 1.4.1.1 Historia............................................................................................................................ 3 1.4.1.2 Generalidades ................................................................................................................. 4 1.4.2 ANAPLASMOSIS BOVINA ........................................................................................................... 5 1.4.2.1 Introducción .................................................................................................................... 5 1.4.2.2 Agente Etiológico ............................................................................................................ 6 1.4.2.2.1 Morfología.................................................................................................................... 6 1.4.2.2.2 Taxonomía .................................................................................................................... 6 1.4.2.2.3 Características moleculares .......................................................................................... 7 1.4.2.2.4 Patogenia ................................................................................................................... 10 1.4.2.3 Transmisión de la enfermedad ...................................................................................... 10 1.4.2.3.1 Transmisión biológica ................................................................................................. 11 1.4.2.3.2 Transmisión mecánica ................................................................................................ 12 1.4.2.4 Síntomas de la enfermedad ........................................................................................... 13 1.4.2.4.1 Fase aguda ................................................................................................................. 13 ix 1.4.2.4.2 Fase hiperaguda ......................................................................................................... 13 1.4.2.4.3 Fase crónica ................................................................................................................ 13 1.4.2.5 Epidemiología de la enfermedad .................................................................................. 14 1.4.3 DIAGNÓSTICO DE LA ENFERMEDAD ........................................................................................... 15 1.4.3.1 Métodos Directos: entre los cuales tenemos: ................................................................ 15 1.4.3.1.1 Métodos de tinción .................................................................................................... 15 1.4.3.1.1.1 Tinción de Giemsa ................................................................................................... 16 1.4.3.1.1.2 Tinción con naranja de acridina-bromuro de etidio .................................................. 16 1.4.3.1.2 Técnicas moleculares .................................................................................................. 17 1.4.3.1.2.1 Hibridación de ácidos nucléicos ............................................................................... 17 1.4.3.1.2.2 PCR .......................................................................................................................... 17 1.4.3.2 Métodos indirectos ....................................................................................................... 22 1.4.3.2.1 Métodos serológicos .................................................................................................. 22 1.4.3.2.1.1 Ensayo inmunoenzimático (ELISA)............................................................................ 22 1.4.3.2.1.1.1 ELISA competitivo ................................................................................................. 24 1.4.3.2.1.1.2 ELISA no competitivo ............................................................................................ 25 1.4.3.2.1.1.2.1 ELISA Directo ..................................................................................................... 25 1.4.3.2.1.1.2.2 ELISA Indirecto ................................................................................................... 26 1.4.3.2.1.2 Inmunofluorescencia indirecta (IFI) .......................................................................... 28 1.4.4 CONTROL DE LA ENFERMEDAD ................................................................................................. 29 1.5 SISTEMA DE HIPÓTESIS ......................................................................................................... 29 CAPÍTULO 2: MATERIALES Y MÉTODOS ......................................................................... 30 2.1 PARTICIPANTES .................................................................................................................. 30 2.2 LUGAR O ZONA DE ESTUDIO ................................................................................................... 31 2.2.1 TRABAJO DE CAMPO ............................................................................................................. 31 2.2.2 TRABAJO DE LABORATORIO ..................................................................................................... 31 2.3 PERIODO DE TIEMPO DE LA INVESTIGACIÓN ............................................................................... 31 2.4 DISEÑO ESTADÍSTICO ........................................................................................................... 31 2.4.1 DISEÑO MUESTRAL (MAS) ..................................................................................................... 32 2.4.1.1 DATOS ............................................................................................................................ 32 2.4.1.2 CÁLCULOS ........................................................................................................................ 33 2.4.1.3 ESTIMACIÓN DE LA MUESTRA ................................................................................................ 34 2.4.1.3.1 DATOS.......................................................................................................................... 34 2.4.1.3.2 CÁLCULOS ..................................................................................................................... 35 2.4.1.4 ESTRATEGIA DIARIA PARA LA TOMA DE MUESTRA EN LOS BOVINOS ................................................ 35 2.5 PROCEDIMIENTOS ............................................................................................................... 36 2.5.1 FASE DE CAMPO ................................................................................................................... 36 2.5.1.1 Recolección, procesamiento y conservación de muestras de sangre .............................. 36 2.5.2 FASE DE LABORATORIO .......................................................................................................... 36 x 2.5.2.1 Microscopía de frotis sanguíneos con tinción Giemsa .................................................... 36 2.5.2.1.1 Frotis sanguíneo de capa fina ..................................................................................... 37 2.5.2.1.2 Preparación de los reactivos para la tinción Giemsa .................................................... 37 2.5.2.1.3 Tinción de Giemsa ...................................................................................................... 38 2.5.2.2 PCR................................................................................................................................ 39 2.5.2.2.1 Cuantificación del ADN (control positivo) por fluorometría ......................................... 41 2.5.2.2.2 Optimización del Sistema de PCR ................................................................................ 42 2.5.2.2.3 Determinación de la sensibilidad analítica .................................................................. 43 2.5.2.2.4 Procesamiento de las muestras .................................................................................. 43 2.5.2.3 cELISA ............................................................................................................................ 43 2.5.2.3.1 Preparación de los reactivos para la prueba de cELISA ................................................ 45 2.5.2.3.2 Etapas del cELISA ........................................................................................................ 45 2.5.2.3.3 Validación de la prueba de cELISA. .............................................................................. 46 2.5.2.3.3.1 Parámetros de validación proporcionados por el kit de cELISA ................................. 46 2.5.2.3.3.2 Cálculo de parámetros de validación para el diagnóstico de A. marginale en muestras de suero de bovinos muestreados en la EMRQ ............................................................................. 47 2.5.2.3.4 Umbral de positividad e interpretación de los resultados............................................ 47 2.5.2.4 Presencia de A. marginale en bovinos muestreados en la EMRQ según edad, sexo y procedencia-pruebas de independencia ....................................................................................... 48 2.5.2.5 Comparación entre las pruebas diagnósticas ................................................................. 48 2.5.2.5.1 Criterios de fiabilidad .................................................................................................. 48 2.5.3 RECOPILACIÓN DE BIBLIOGRÁFICA ............................................................................................. 50 2.6 ANÁLISIS DE DATOS ............................................................................................................. 50 CAPÍTULO 3: RESULTADOS ................................................................................................. 52 3.1 ASPECTOS ZOOTÉCNICOS DE LOS BOVINOS MUESTREADOS EN LA EMRQ .......................................... 52 3.2 DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE A. MARGINALE EN LA EMRQ ................................................ 53 3.2.1 MICROSCOPÍA DE FROTIS SANGUÍNEO ....................................................................................... 54 3.2.1.1 Presencia de A. marginale en bovinos muestreados en la EMRQ según edad, sexo y procedencia mediante la técnica de microscopía de frotis sanguíneo ........................................... 55 3.2.1.1.1 Edad ........................................................................................................................... 55 3.2.1.1.2 Sexo ........................................................................................................................... 55 3.2.1.1.3 Procedencia ................................................................................................................ 56 3.2.2 PCR .................................................................................................................................. 57 3.2.2.1 Cuantificación de ADN ................................................................................................... 57 3.2.2.2 Optimización del sistema de PCR ................................................................................... 57 3.2.2.2.1 Ensayo de gradiente de temperatura .......................................................................... 57 3.2.2.2.2 Ensayo de adyuvantes ................................................................................................ 58 3.2.2.3 Ensayo de sensibilidad analítica ..................................................................................... 60 3.2.2.4 Procesamiento de las muestras ..................................................................................... 61 xi 3.2.2.5 Presencia de A. marginale en bovinos muestreados en la EMRQ según sexo, edad y procedencia mediante la técnica de PCR ...................................................................................... 68 3.2.2.5.1 Edad ........................................................................................................................... 68 3.2.2.5.2 Sexo ........................................................................................................................... 68 3.2.2.5.3 Procedencia ................................................................................................................ 69 3.2.3 CELISA .............................................................................................................................. 70 3.2.3.1 Cálculo de parámetros de validación para el diagnóstico de A. marginale en muestras de suero de bovinos muestreados en la EMRQ ................................................................................. 70 3.2.3.2 Umbral de positividad e interpretación de los resultados .............................................. 70 3.2.3.3 Presencia de A. marginale en bovinos muestreados en la EMRQ según sexo, edad y procedencia mediante la técnica de cELISA .................................................................................. 72 3.2.3.3.1 Edad ........................................................................................................................... 72 3.2.3.3.2 Sexo ........................................................................................................................... 72 3.2.3.3.3 Procedencia ................................................................................................................ 73 3.3 COMPARACIÓN DE LAS 3 TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO: MICROSCOPÍA DE FROTIS SANGUÍNEO, PCR Y CELISA PARA LA DETECCIÓN DE A. MARGINALE EN LOS BOVINOS MUESTREADOS EN LA EMRQ ................................. 74 3.3.1 DETERMINACIÓN DE CRITERIOS DE FIABILIDAD: ............................................................................ 74 3.3.1.1 Validación de microscopía de frotis sanguíneo con respecto a PCR ................................ 75 3.3.1.2 Validación de cELISA con respecto a PCR ....................................................................... 76 3.4 COMPARACIÓN DE 4 TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO: MICROSCOPÍA DE FROTIS SANGUÍNEO, PCR, CELISA Y IELISA PARA LA DETECCIÓN DE A. MARGINALE EN LOS BOVINOS MUESTREADOS EN LA EMRQ ....................... 78 3.5 RECOPILACIÓN DE BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................. 78 3.5.1 EPIDEMIOLOGÍA DE ANAPLASMOSIS EN EL ECUADOR ..................................................................... 78 CAPÍTULO 4: DISCUSIÓN ...................................................................................................... 81 4.1 MICROSCOPÍA DE FROTIS SANGUÍNEO ...................................................................................... 81 4.2 PCR ................................................................................................................................ 84 4.3 CELISA ............................................................................................................................ 87 4.4 CONSIDERACIONES GENERALES SOBRE LA EDAD, SEXO Y PROCEDENCIA DE LOS BOVINOS ....................... 91 4.5 COMPARACIÓN ENTRE LAS TÉCNICAS ....................................................................................... 92 4.6 ANAPLASMOSIS EN EL ECUADOR ............................................................................................. 94 CAPÍTULO 5: CONCLUSIONES ............................................................................................ 97 CAPÍTULO 6: RECOMENDACIONES ................................................................................... 99 CAPÍTULO 7: BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................ 100 ANEXOS .................................................................................................................................. 120 xii LISTADO DE TABLAS Tabla 1.1. Distribución geográfica y prevalencia de anaplasmosis en el Continente Americano .... 15 Tabla 2.1. Faenamiento bovino comparativo anual (1996-2008) de la Empresa Metropolitana de Rastro de Quito (EMRQ). .............................................................................................................. 32 Tabla 2.2. Estrategia diaria para la toma de muestras de los bovinos faenados en la Empresa Metropolitana de Rastro de Quito (EMRQ). .................................................................................. 35 Tabla 2.3. Primer utilizados para la amplificación de un fragmento de 200 pares de bases del gen MPS5 de Anaplasma marginale ................................................................................................... 39 Tabla 2.4. Descripción sistemática del procedimiento de cELISA .................................................. 46 Tabla 3.1. Distribución por edad y sexo de los bovinos muestreados en la Empresa Metropolitana de Rastro de Quito (EMRQ). ......................................................................................................... 52 Tabla 3.2. Prevalencia de Anaplasma marginale en bovinos muestreados en la EMRQ según la edad mediante la técnica de microscopía de frotis sanguíneo ...................................................... 55 Tabla 3.3. Prevalencia de Anaplasma marginale en bovinos muestreados en la EMRQ según la edad mediante la técnica de PCR ................................................................................................. 68 Tabla 3.4. Densidad óptica (D.O.) del control positivo y control negativo para la prueba cELISA. .. 70 Tabla 3.5. Resultados obtenidos con la técnica de cELISA en las muestras de suero de los bovinos muestreados en la Empresa metropolitana de rastro de Quito (EMRQ). ....................................... 71 Tabla 3.6. Prevalencia de Anaplasma marginale en bovinos muestreados en la EMRQ según la edad mediante la técnica de cELISA ............................................................................................. 72 Tabla 3.7. Comparación entre las tres pruebas diagnósticas para determinar la Prevalencia de Anaplasma marginale en bovinos faenados en la EMRQ. ............................................................. 74 Tabla 3.8. Concordancia entre las técnicas de PCR y microscopía de frotis sanguíneo para el diagnóstico de Anaplasma marginale en bovinos muestreados en la Empresa metropolitana de Rastro de Quito (EMRQ). .............................................................................................................. 76 Tabla 3.9. Concordancia entre las técnicas de PCR y cELISA para el diagnóstico de Anaplasma marginale en bovinos muestreados en la Empresa metropolitana de Rastro de Quito (EMRQ). .... 77 Tabla 3.10. Comparación entre las cuatro pruebas diagnósticas para determinar la Prevalencia de Anaplasma marginale en bovinos muestreados en la EMRQ. ....................................................... 78 Tabla 3.11. Estudio de la prevalencia de anaplasmosis determinada en Ecuador .......................... 80 xiii LISTADO DE CUADROS Cuadro 1.1. Especies del género Anaplasma .................................................................................. 5 Cuadro 2.1. Reactivos necesarios para la tinción Giemsa ............................................................. 38 Cuadro 2.2. Master mix necesaria para la PCR ............................................................................. 40 Cuadro 2.3. Condiciones para la amplificación del gen MPS5 de Anaplasma marginale................ 41 Cuadro 2.4. Reactivos necesarios para la cuantificación de ADN. ................................................. 41 Cuadro 2.5. Reactivos necesarios para la prueba de cELISA .......................................................... 45 Cuadro 3.1. Cuantificación por fluorometría del ADN (control positivo) ....................................... 57 Cuadro 3.2. Condiciones óptimas para la amplificación de Anaplasma marginale. ....................... 59 Cuadro 3.3. Cuantificación de ADN de las diluciones seriadas de Anaplasma marginale. .............. 60 xiv LISTADO DE FIGURAS Figura 1.1. Ciclo de desarrollo de Anaplasma marginale en bovinos y garrapatas (Kocan et al., 2003). .......................................................................................................................................... 12 Figura 1.2. Descripción del proceso de PCR en los primeros ciclos de reacción (Satz & Kornblihtt, 1993). .......................................................................................................................................... 21 Figura 1.3. Principio de la prueba de ELISA tipo competitivo (Docstoc, 2009). ............................. 24 Figura 1.4. Principio de la prueba de ELISA tipo sándwich (Bouchard, 2009). ............................... 25 Figura 1.5. Principio de la prueba de ELISA indirecto (Docstoc, 2009). ......................................... 27 Figura 2.1. Faenamiento bovino comparativo anual – Empresa Metropolitana de Rastro de Quito (EMRQ). ....................................................................................................................................... 33 Figura 2.2. Diluciones seriadas del ADN de Anaplasma marginale (control positivo) .................... 43 Figura 3.1. Procedencia de los bovinos muestreados en la Empresa Metropolitana de Rastro de Quito (EMRQ). ............................................................................................................................. 53 Figura 3.2. Frecuencia de bovinos positivos y negativos a Anaplasma marginale por microscopía de frotis sanguíneo, PCR y cELISA, expresada en porcentajes ............................................................ 54 Figura 3.3. Microscopía de frotis sanguíneo con tinción Giemsa 100X .......................................... 54 Figura 3.4. Prevalencia de Anaplasma marginale en bovinos muestreados en la EMRQ según el sexo mediante la microscopía de frotis sanguíneo ........................................................................ 56 Figura 3.5. Prevalencia de Anaplasma marginale en bovinos muestreados en la EMRQ según la procedencia del mismo mediante microscopía de frotis Sanguíneo .............................................. 56 Figura 3.6. Ensayo de gradiente de temperatura .......................................................................... 58 Figura 3.7. Ensayo de adyuvantes ................................................................................................ 58 Figura 3.8. Sensibilidad analítica por concentración de ADN. ....................................................... 60 Figura 3.9. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para el diagnóstico de A. marginale en muestras de ADN de sangre de bovinos muestreados en EMRQ. .................................................. 61 Figura 3.10. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para el diagnóstico de A. marginale en muestras de ADN de sangre de bovinos muestreados en EMRQ. .................................................. 62 Figura 3.11. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para el diagnóstico de A. marginale en muestras de ADN de sangre de bovinos muestreados en EMRQ. .................................................. 62 Figura 3.12. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para el diagnóstico de A. marginale en muestras de ADN de sangre de bovinos muestreados en EMRQ. .................................................. 63 Figura 3.13. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para el diagnóstico de A. marginale en muestras de ADN de sangre de bovinos muestreados en EMRQ. .................................................. 64 Figura 3.14. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para el diagnóstico de A. marginale en muestras de ADN de sangre de bovinos muestreados en EMRQ. .................................................. 64 Figura 3.15. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para el diagnóstico de A. marginale en muestras de ADN de sangre de bovinos muestreados en EMRQ. .................................................. 65 Figura 3.16. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para el diagnóstico de A. marginale en muestras de ADN de sangre de bovinos muestreados en EMRQ. .................................................. 66 xv Figura 3.17. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para el diagnóstico de A. marginale en muestras de ADN de sangre de bovinos muestreados en EMRQ. .................................................. 66 Figura 3.18. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para el diagnóstico de A. marginale en muestras de ADN de sangre de bovinos muestreados en EMRQ. .................................................. 67 Figura 3.19. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para el diagnóstico de A. marginale en muestras de ADN de sangre de bovinos muestreados en EMRQ. .................................................. 67 Figura 3.20. Prevalencia de Anaplasma marginale en bovinos muestreados en la EMRQ según el sexo mediante la técnica de PCR .................................................................................................. 69 Figura 3.21. Prevalencia de Anaplasma marginale en bovinos muestreados en la EMRQ según la procedencia mediante la técnica de PCR ...................................................................................... 69 Figura 3.22. Prevalencia de Anaplasma marginale en bovinos muestreados en la EMRQ según el sexo en bovinos positivos mediante la técnica de cELISA. ............................................................. 73 Figura 3.23. Prevalencia de Anaplasma marginale en bovinos muestreados en la EMRQ según la procedencia mediante la técnica de cELISA. ................................................................................. 73 xvi LISTADO DE ANEXOS Anexo A. Proceso de faenamiento en la Empresa Metropolitana de rastro de Quito (EMRQ). .... 120 Anexo B. Electroforesis horizontal en geles de agarosa al 2% ..................................................... 122 Anexo C. Información general de los bovinos muestreados en la Empresa Metropolitana de Rastro de Quito (EMRQ). ....................................................................................................................... 123 Anexo D. Abreviaturas ............................................................................................................... 127 xvii RESUMEN Se realizó un estudio con la finalidad de determinar la prevalencia de Anaplasma marginale en bovinos muestreados en la Empresa Metropolitana de Quito. Para ello se evaluó 181 muestras por medio de la técnica de microscopía de frotis sanguíneo, reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y ensayo inmunoenzimático competitivo (cELISA). A través de la técnica de microscopía de frotis sanguíneo, se obtuvo una prevalencia de 28,18% (51/181); por la técnica de PCR de 91,71% (166/181) mientras que por cELISA fue de 91,16% (165/181). No se encontraron diferencias significativas con relación a la presencia de Anaplasma marginale y la edad, sexo y procedencia de los animales. La provincia con mayor número de animales muestreados fue la provincia de Sto. Domingo de los Tsachilas. Se realizaron tablas de doble entrada, donde se compararon la microscopía de frotis sanguíneo y cELISA con respecto a la PCR. La PCR fue considerada como la técnica gold standard y se midieron parámetros como sensibilidad, especificidad y valores predictivos, obteniéndose para la microscopía de frotis sanguíneo una sensibilidad de 28,92, especificidad de 80 %, valor predictivo positivo de 94,12% y valor predictivo negativo del 9,23%, para la identificación de A. marginale. Para la técnica de cELISA se determinó una sensibilidad de 96,39%, una especificidad de 66,67%, valor predictivo positivo de 96,97% y valor predictivo negativo del 62,50%, para la detección de anticuerpos IgG en los bovinos muestreados. La recopilación bibliográfica realizada en la costa ecuatoriana, permitió conocer que la técnica más usada para la determinación de la prevalencia de anaplasmosis fue la microscopia de frotis sanguíneo con tinción Giemsa. xviii ABSTRACT A study was made for the purpose of determining the prevalence of Anaplasma marginale in cattle sampled at the Metropolitan Company of Quito. We evaluated 181 samples using the technique of blood smear microscopy, polymerase chain reaction (PCR), and competitive enzyme immunoassay (cELISA). Through the technique of blood-smear microscopy, we obtained a prevalence of 28.18% (51/181); by PCR 91.71% (166/181), while on the cELISA was 91.16% (165/181). No significant differences were found in relation with the presence of Anaplasma marginale and age, gender and origin of animals, the province with the largest number of animals sampled was the province of Sto. Domingo de los Tsachilas. Tables of double entry, comparing the blood smear microscopy and cELISA with relation to the PCR. The PCR was considered the gold standard technique and measured parameters such as sensitivity, specificity and predictive values, obtained for blood smear microscopy 28.92 sensitivity, specificity of 80%, positive predictive value 94.12% and negative predictive value of 9.23%, for the identification of A. marginale. For cELISA technique identified 96.39% sensitivity and a specificity of 66.67% positive predictive value 96.97% and negative predictive value 62.50% for the detection of IgG antibodies in cattle sampled. Bibliographic collection on the Ecuadorian coast, allowed knowing the technique used to determine the prevalence of anaplasmosis was blood smear microscopy with Giemsa staining. 1 CAPÍTULO 1: INTRODUCCIÓN 1.1 Formulación del problema Las enfermedades parasitarias del ganado constituyen un problema en la salud y producción de las poblaciones animales, aumentando los costos de producción y por tanto, con efectos económicos negativos en el desarrollo de la ganadería, dadas las pérdidas severas que éstos ocasionan, especialmente en regiones tropicales y subtropicales, en donde las condiciones ambientales son favorables para el desarrollo de los parásitos. Entre estas enfermedades figura la anaplasmosis, la cual tiene una amplia distribución mundial, causando una importante pérdida económica y sanitaria en la ganadería bovina en zonas endémicas. Esta enfermedad, constituye un gran limitante en reproductores con alto potencial genético para el mejoramiento del rendimiento productivo. Su acción patógena se traduce en pérdidas de productividad (disminución de leche, influye negativamente en la ganancia de peso de animales de engorde y en el desarrollo de las crías) y mortalidad, cuyo tratamiento y control exige un gran costo (Cipolini et al., 2004). 1.2 Justificación del problema La anaplasmosis representa un problema de importancia para los ganaderos debido a las secuelas que esta provoca, tanto en la parte productiva como reproductiva de los animales que la padece, dando lugar a pérdidas económicas significativas. La anaplasmosis fue identificada desde mucho tiempo atrás en el Ecuador, según datos proporcionados se ha llegado a establecer que la enfermedad fue diagnosticada 2 clínicamente por el Dr. Wladimir Kube en 1928 (Villafuerte, 2001), su presencia fue evidenciada mediante la utilización de métodos de tinción del frotis sanguíneo, cuya sensibilidad es baja y especificidad es alta, comparadas con las técnicas moleculares y serológicas actualmente disponibles. Sin embargo en el Ecuador, no se ha realizado investigaciones sobre el diagnóstico de anaplasmosis con técnicas más específicas y sensibles que reflejen una situación precisa como son la Reacción en cadena de la Polimerasa (PCR) del inglés Polimerase Chain Reaction y de la prueba Inmunoenzimática (ELISA) del inglés Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay. La utilización de técnicas más sensibles y específicas permitirán determinar la presencia de Anaplasmosis en los hatos ganaderos y así poder estimar su prevalencia, esta información permitirá el establecimiento de un programa de control de la enfermedad o la incorporación de medidas preventivas oportunas para mejorar la producción ganadera en las zonas de estudio. Dada la trascendencia de esta enfermedad dentro del campo económico y de sanidad animal, es necesario estandarizar los métodos de diagnóstico para así sugerir campañas o programas de control y erradicación, incluyendo medidas terapéuticas y profilácticas que tiendan a suprimir las fuentes primarias de infección (Martínez, 1975). 1.3 Objetivos de la investigación 1.3.1 Objetivo general Determinar la prevalencia de anaplasmosis en el ganado bovino faenado en la Empresa Metropolitana de Rastro de Quito (EMRQ) mediante la aplicación de las técnicas de diagnóstico: microscopía de frotis sanguíneos, PCR y cELISA. 3 1.3.2 Objetivos específicos - Aplicar la técnica de microscopía de frotis sanguíneo con tinción Giemsa para la identificación de A. marginale. - Optimizar la técnica de PCR para la identificación de A. marginale en muestras de sangre del ganado bovino. - Utilizar la prueba de cELISA para la detección de anticuerpos IgG de A. marginale. - Recopilar y analizar información de trabajos sobre anaplasmosis en el Ecuador. 1.4 Marco Teórico 1.4.1 Anaplasmosis 1.4.1.1 Historia Smith y Kilborne en el año de 1893, en el transcurso de sus investigaciones relacionadas con la Fiebre de la garrapata causada por un hemoparásito conocido como Babesia, realizaron la primera descripción de Anaplasma marginale como pequeños corpúsculos puntiformes o en forma de cocos, dentro de los glóbulos rojos de los animales infectados y los consideraron como representantes de un estadio del ciclo de Babesia bigemina. Sir Arnold Theiler en el año de 1910 usó el término “Anaplasma” para describir un pequeño microorganismo (corpúsculos) que se encontraba presente en los eritrocitos de bovinos africanos que sufrían de una anemia infecciosa aguda, fue el primero en considerar estos corpúsculos como representantes de un nuevo género de parásito y propuso el nombre de A. marginale, debido a la carencia de citoplasma y a su localización marginal dentro del glóbulo rojo, a la enfermedad la denominó como Anaplasmosis. Durante este periodo al microorganismo recién descubierto se le consideraba como un nuevo género de protozoario e incluso Seiber en el año de 1911 notó características en el comportamiento clínico y patológico del agente que lo asemejaba más a un virus (Figueroa, 1994). 4 Gracias a la implementación de la microscopía electrónica, De Robertis y Epstein en el año de 1951 evidenciaron que no se trataba de un protozoario ya que al observar la morfología del Anaplasma concluyeron que el cuerpo marginal no era una estructura homogénea sino que el cuerpo de inclusión estaba formado por varias subunidades. Posteriormente los estudios histoquímicos en el año de 1955, demostraron la presencia de dos ácidos nucléicos que contradecía la teoría vírica. En el año de 1961, Pilcher determinó que el Anaplasma pertenecía al género Rickettsia y concluyó además que los glóbulos rojos parasitados con Anaplasma consumen el doble del oxígeno que los glóbulos rojos normales condición que no ocurre en glóbulos rojos parasitados con virus (Figueroa, 1994). Kreir y Ristic en el año de 1973, basándose en las características que poseía el Anaplasma como la ausencia de núcleo y organelos, le clasificaron dentro de la familia Anaplasmataceae del orden Rickettsiales. (Figueroa, 1994). 1.4.1.2 Generalidades La Anaplasmosis es una enfermedad hemoparasitaria, que afecta a bovinos, ovinos, caprinos, búfalos y algunos rumiantes salvajes. Está ampliamente distribuida en zonas tropicales y subtropicales del mundo y se caracteriza por la presencia de anemia hemolítica, disminución del peso, aborto y en muchos casos la muerte de los animales afectados (Viseshakul, 2002). Se conocen varias especies de este género las cuales pueden afectar diferentes células y a diferentes especies animales (Cuadro 1.1.). 5 Cuadro 1.1. Especies del género Anaplasma 1.4.2 Anaplasmosis bovina 1.4.2.1 Introducción La anaplasmosis bovina es una enfermedad causada por A. marginale, que es la más patógena para los bovinos y A. centrale, causante de una relativa forma benigna de anaplasmosis en bovinos (Ristic & Kreir, 1984), que tiene un curso agudo, sobreagudo o crónico, variando su gravedad de acuerdo a la edad del animal, generalmente moderada en becerros de hasta un año de edad; aguda, pero no fatal en animales de hasta dos años de edad; aguda y ocasionalmente fatal en bovinos de hasta tres años de edad e hiperaguda y frecuentemente fatal en animales de tres años en adelante (Bautista, 1996). Los principales síntomas que presenta el bovino afectado son inapetencia, depresión, debilidad, elevada temperatura corporal (raramente supera los 41º C), rápida caída de la producción láctea en vacas en lactación, anemia, marcada ictericia, trastornos digestivos, deshidratación y abortos. No se presenta hemoglobinuria (SENASA, 2006). Tipo Células Hospedador Distribución Geográfica Anaplasma phagocytophila Granulocitos Humanos Europa América del Norte y del Sur Norte de Africa Anaplasma equi Granulocitos Equinos Europa Estados Unidos Anaplasma platys Plaquetas Perros América del Norte y del Sur Anaplasma marginale Anaplasma centrale Anaplasma ovis Eritrocitos Ovinos y caprinos Estados Unidos Estados Unidos, Costa Rica, Venezuela, Colombia, Brasil, Paraguay, Argentina Eritrocitos Bovinos (Reyna, 2009 & Blanco et al , 2007). 6 La anaplasmosis se puede transmitir por varios mecanismos uno de los más comunes es a través de insectos hematófagos como garrapatas del género Boophilus spp y Tabanus spp, otra forma de transmisión es a través de agujas, jeringas, mochetas y otros instrumentos empleados en las prácticas rurales contaminados que facilitan el pasaje de sangre rápidamente de un bovino infectado a otro susceptible (Alcaraz, 1999). 1.4.2.2 Agente Etiológico 1.4.2.2.1 Morfología A. marginale es una rickettsia intraeritrocitaria gram negativa que al microscopio ofrece el aspecto de una inclusión redondeada, basófila, pequeña (0,3-1µm), única o doble, generalmente localizada a lo largo del margen del eritrocito; consta de un cuerpo inicial, que invade el eritrocito y posteriormente se multiplica para formar inclusiones con 4 a 8 cuerpos iniciales (Del Cura, 2003), se caracteriza como todas las rickettsias, por no tener su cromatina organizada en un núcleo con membrana limitante y por carecer de retículo endoplásmico (Rodríguez et al., 2003). 1.4.2.2.2 Taxonomía Pertenece: Genogrupo II de las Ehrlichias Super Reino: Bacteria Clase: Proteobacteria Subclase: Alfa Orden: Rickettsiales Familia: Anaplasmataceae Género: Anaplasma Especie: A. marginale A. centrale 7 1.4.2.2.3 Características moleculares Posee ADN circular de doble cadena, cuya talla total oscila entre 1.200 y 1.250 kpb, presenta seis genes (msp1α, msp1β, msp2, msp3, msp4 y msp5), que codifican para las proteínas mayoritarias de superficie (MSPs) de los cuerpos iniciales de este organismo, designadas 1a, 1b, 2,3,4 y 5. (Tebele & McGuire, 1991). El gen msp1α codifica para la proteína MSP1a y se encuentra representado en el genoma por una simple copia, posee un alto polimorfismo de talla entre los aislamientos de distintas regiones geográficas, debido a que posee secuencias oligonucleotídicas repetidas en tandem. Estas secuencias se encuentran repetidas en el gen 2, 4, 6 y 8 veces en los aislamientos Virginia, Washington, Idaho y Florida respectivamente y 5 veces en el aislamiento Habana. Este gen ha sido utilizado para la diferenciación y detección específica de aislamientos de A. marginale (Lew et al., 2002). El gen msp1β está formado por una familia de multigenes, compuesta al menos por cuatro copias. Este gen también presenta dominios de secuencias repetidas, al igual que msp1α, aunque son de menor extensión (Camacho et al., 2000). El gen msp2 está formado por una familia multigénica, presenta una gran variabilidad fundamentalmente en su extremo 5’ y codifica para moléculas proteicas estructuralmente distintas, las cuales presentan epítopes B diferentes, en las regiones con alto polimorfismo de aminoácidos (French et al., 1998). El gen msp3 forma parte también de una familia multigénica, cuyas copias se encuentran ampliamente distribuidas a través del cromosoma (Alleman & Barbet, 1996). 8 El gen msp4 se encuentra como una simple copia en el genoma de A. marginale y codifica para una proteína de 31 kDa (MSP4) (Oberle et al., 1993, Palmer et al., 1988, Corona et al., 2000). Este gen proporciona información filogenética sobre la evolución de los aislamientos de A. marginale (De la Fuente et al., 2002). El gen msp5 está representado en el genoma como una simple copia, altamente conservada entre las cepas de A. marginale estudiadas. La presencia del gen en todas las especies de Anaplasma, incluyendo A. ovis, sugiere que este gen es esencial en el ciclo de vida del parásito, lo que avala el uso del mismo para el desarrollo de procedimientos de diagnóstico molecular (Visser et al., 1992). Hasta el presente se han caracterizado seis proteínas mayoritarias de superficie (MSPs) nombradas como MSP1a (105KDa) y MSP1b (100-105KDa), MSP2 (36KDa), MSP3 (86KDa), MSP4 (31KDa) y la MSP5 (19KDa) (Corona et al., 2001). MSP1está compuesta por dos subunidades MSP1a y MSP1b, unidas por enlace disulfuro. El complejo y las dos subunidades separadas, median la adherencia a los eritrocitos bovinos es decir funcionan como adhesivas. MSP2 está presente en la membrana como un tetrámero adyacente a las proteínas MSP1, MSP3 y MSP4. Sus subunidades están unidas mediante puentes disulfuro, esta proteína es altamente polimórfica, con presencia de epítopes conservados, aunque presenta epítopes B diferentes, en las regiones polimórficas (Eid et al., 1996). MSP3 está codificada por una familia multigénica, es también inmunodominante durante las infecciones natural y experimental. Se puede encontrar además en A. centrale y 9 A. ovis. Es estructural y antigénicamente diferente entre cepas de A. marginale, presenta polimorfismo de talla entre aislamientos geográficamente diferentes (Meeus et al., 2003). MSP4 es altamente conservada entre los distintos aislamientos de A. centrale y A. marginale. Esta proteína contiene bloques de aminoácidos relacionados con la proteína MSP2. Sus epítopes conservados son de gran importancia tanto para el diagnóstico como para el desarrollo de una vacuna (Tebele & McGuire, 1991; Oberle et al., 1993). MSP5 es una proteína conservada en todas las cepas conocidas de A. marginale, A. centrale y A. ovis (Eleizalde et al., 2007) es de poca complejidad estructural y muy importante en el ciclo de vida celular, aunque se desconoce exactamente su función. Se ha reconocido su homólogo en todos estas, estructuralmente se presenta en forma multimérica unida por puentes disulfuro que le ayudan a mantener su conformación terciaria (Visser et al., 1992), necesaria para su reconocimiento por anticuerpos de bovinos expuestos a la rickettsia, también se expresa en garrapatas infectadas, que sirve para diagnóstico en bovinos y vectores (Knowles et al., 1996). Dada su amplia presencia en todos los aislados hasta ahora estudiados (Munodzana et al., 1998), se ha usado con éxito en ensayos diagnósticos en diferentes partes del mundo (Reyna-Bello et al., 1998; Shkap et al., 1990; Torioni de Echaide et al., 1998). El Ac monoclonal ANAF16C1 reconoce un epítope inmunodominante en esta proteína, lo que requiere las regiones C y N terminales MSP5, indicando su naturaleza conformacional (Munodzana et al., 1998). Debido a las características de conservación del epítope reconocido por este Ac, entre diferentes especies y cepas de Anaplasma, fue utilizado para desarrollar una prueba de inmunoensayo ligado a enzimas de competencia (cELISA) capaz de detectar Ac contra A. marginale y A. ovis con alta sensibilidad y especificidad, incluso en animales persistentemente infectados (Ndung'c et al. 1995; Knowles et al., 1996). La presencia de Ac contra el epítope definido por Ac monoclonal ANAF16C1 en sueros de animales infectados indica que este epítope es un Ag potencial 10 para el uso en la identificación de los bovinos persistentemente infectados (Visser et al., 1992). 1.4.2.2.4 Patogenia Es una bacteria intracelular obligada que una vez dentro del torrente sanguíneo, penetra en los eritrocitos maduros por endocitosis; infectando estos con la formación de una vacuola en donde se multiplica por fisión binaria para formar hasta ocho organismos individuales dentro de una sola vacuola y luego, nuevos organismos salen del eritrocito, utilizando exocitosis e infectan los eritrocitos aledaños (Figueroa et al., 1993a). Después que el parásito entra al huésped el número de eritrocitos infectados se duplica entre las 24 y 48 horas siguientes. El período prepatente durante la incubación de la enfermedad es de dos a tres semanas y la duración depende de la cantidad de organismo infectante (Medellín, 2003). La infección puede detectarse por microscopía entre 20 y 40 días después de la transmisión, dependiendo del número de microorganismos transmitidos y de la virulencia (Bautista, 1996). 1.4.2.3 Transmisión de la enfermedad El estudio de la transmisión de A. marginale es de fundamental importancia para establecer un control efectivo de la enfermedad. Son amplias y muy variadas las formas en que puede transmitirse el parásito y dependen de la presencia de vectores (biológicos y mecánicos), la existencia de animales susceptibles y de condiciones ecológicas favorables (Palmer & McElwain, 1995). La transmisión de esta enfermedad se puede efectuar de diferentes maneras, biológica y mecánica. 11 1.4.2.3.1 Transmisión biológica La transmisión biológica de A. marginale es a través de las diferentes especies de garrapatas se efectúa de forma transestadial, es decir de una etapa a otra por ejemplo del estado de larvas a ninfas y de ninfas a adultos o intraestadial, es decir dentro de una etapa (Kocan et al., 1981; Kocan et al., 1986). El ciclo de desarrollo de A. marginale (Figura 1.1.), en garrapatas es complejo y coordinado con el ciclo de alimentación (Kocan, 1986; Kocan et al., 1992; Kocan et al., 1996), comienza en las células del intestino medio, siguiendo con las células musculares del mismo, después muchos otros tejidos de la garrapata lleguen a ser infectados, incluyendo las glándulas salivales, de donde la rickettsiae se transmite al huésped vertebrado durante la alimentación . En cada sitio de desarrollo en la garrapata, A. marginale se multiplica dentro de inclusiones unidas a las membranas, llamadas vacuolas o colonias. Cada ciclo involucra dos estadios: la primera forma de A. marginale vista dentro de la colonia es la forma reticular (vegetativa), que divide por fisión binaria, formando colonias grandes que pueden contener cientos de organismos. La forma reticular cambia a la forma densa, que es la forma infecciosa y que puede sobrevivir fuera de las células de anfitrión. El ganado llega a ser infectado con A. marginale cuando la forma densa es transmitida durante la alimentación de la garrapata a través de las glándulas salivales (Kocan et al., 2003). 12 Figura 1.1. Ciclo de desarrollo de Anaplasma marginale en bovinos y garrapatas (Kocan et al., 2003). 1.4.2.3.2 Transmisión mecánica La transmisión mecánica con frecuencia se produce por dípteros chupadores de sangre del género Tabanus spp, esta forma de transmisión se considera la principal vía de difusión de A. marginale en áreas de Centro y Sur América y África, además a través de instrumentos contaminados como agujas, descornadoras, instrumentos de tatuaje o marcación, dispositivo de etiquetado del oído e instrumentos usados en la castración (Coronado, 2001; Figueroa et al., 1999). 13 1.4.2.4 Síntomas de la enfermedad Un animal infectado no presenta síntomas clínicos al inicio de la infección, solamente cuando más del 15 % de los eritrocitos han sido parasitados o infectados, se presentan síntomas. En ese período, la parasitemia comienza a desarrollarse y posteriormente los eritrocitos infectados se eliminan del torrente circulatorio mediante fagocitosis por las células del retículo endotelial del bazo, hígado y nódulos linfáticos; induciéndose el desarrollo de una fase de inflamación aguda (Richey & Palmer, 1990). 1.4.2.4.1 Fase aguda El primer signo clínico es la fiebre de hasta 41ºC, seguida de anorexia, depresión, debilidad muscular e ictericia (Richey & Palmer, 1990) 1.4.2.4.2 Fase hiperaguda En ésta fase ocurre una pérdida dramática de peso, presencia de abortos, fallo cardiopulmonar y muerte, debido a que el 90% de los eritrocitos están infectados, > 108 eritrocitos infectados por mL (Kieser, Eriks & Palmer, 1990). 1.4.2.4.3 Fase crónica Los animales que sobreviven a la fase hiperaguda, disminuyen drásticamente la parasitemia, luego de varias semanas los valores hematológicos vuelven a la normalidad. El ganado recuperado puede permanecer infectado persistentemente con bajos niveles de parasitemia, a estos animales se los conoce como “portadores asintomáticos de la enfermedad”, en esta fase es difícil de diagnosticar la enfermedad por los métodos tradicionales (Viseshakul, 2002). 14 Algunos animales afectados, pueden desarrollar esta fase de la enfermedad sin manifestaciones clínicas. Esta fase además de presentarse como secuela de la convalecencia de las infecciones agudas, también puede ser el resultado de una infección inducida con cepas atenuadas (Palmer & McGuire, 1995). 1.4.2.5 Epidemiología de la enfermedad La anaplasmosis se encuentra ampliamente distribuida en todas las regiones tropicales y subtropicales de todo el mundo donde sus vectores (garrapatas y dípteros hematófagos) encuentran un hábitat ideal dadas las condiciones edafoclimáticas que garantizan su evolución durante todas las épocas del año (Alfaro et al., 1998). En los Estados Unidos, la anaplasmosis ha sido reportada en casi todos los estados y su distribución puede ser mayor debido al transporte de ganado, también es endémica en México, Centroamérica, Sudamérica y las islas del Caribe. La seroprevalencia de A. marginale varía ampliamente entre los países del Continente Americano (Tabla 1.1.), y esta variabilidad contribuye al desarrollo de las regiones enzoóticas geográficamente estables o inestables. 15 Tabla 1.1. Distribución geográfica y prevalencia de anaplasmosis en el Continente Americano 1.4.3 Diagnóstico de la enfermedad 1.4.3.1 Métodos Directos: entre los cuales tenemos: 1.4.3.1.1 Métodos de tinción País Prevalencia (%) Técnica a Autor Estados Unidos (Louisiana) 5,6 CT Hugh-Jones et al (1998, citado por Kocan et al , 2003) Estados Unidos (Oklahoma) 4,7–17,6 CF b Rodgers et al (1994, citado por Kocan et al , 2003) Costa Rica 61–90 cELISA, PCR Herrero et al (1998, citado por Kocan et al , 2003) Venezuela 57,7 IFA Meléndez & Forlano (1997, citado por Kocan et al , 2003) Colombia 64–100 IFA Otte (1992, citado por Kocan et al , 2003) Brazil 67,3 IFA Vidotto et al (1997, citado por Kocan et al , 2003) Paraguay 92 CT Payne & Osorio, O. (1990, citado por Kocan et al , 2003) Argentina 7–61 Frotis sanguíneo Lignieres (1998, citado por Kocan et al , 2003) Jamaica 69,9 CT McGinnis et al (1988, citado por Kocan et al , 2003) Antillas menores 18-71 Dot ELISA Camus & Montenegro-James (1994, citado por Kocan et al , 2003) b Los resultados de la técnica fijación del complemento provienen de una estimación mínima de bovinos seropositivos y es probable que no reportan la prevalencia real de A. marginale (Kocan et al , 2003) a CT, Aglutinación en placa o prueba de tarjeta; CF, Fijación del complemento; cELISA, Ensayo inmunoenzimático competitivo; PCR, reacción en cadena de la Polimerasa, IFA, Ensayo de inmunofluorescencia indirecta; Dot ELISA, Enzimoinmunoensayo de punto 16 1.4.3.1.1.1 Tinción de Giemsa El examen microscópico de frotis sanguíneo con tinción de Giemsa, es la técnica diagnóstica de referencia y el método más común para la identificación de A. marginale en animales con infección clínica (OIE, 2004). Sin embargo, cuando el animal está en la fase crónica o en el estadío de portador no expresa un elevado nivel de parasitemia como para ser detectado por la tinción (Trueblood & Palmer, 1998). Para realizar la tinción Giemsa se requiere emplear agua tamponada a pH 7,2 tanto en la dilución del colorante como en los lavados, ya que con otro pH, puede verse alterada la morfología de la bacteria (Turriente & López-Vélez, 2007). Esta tinción es capaz de detectar niveles de parasitemia de 0.1 a 0.2%, es decir detecta niveles mayores a 106 eritrocitos infectados por mililitro de sangre (Gale et al., 1996), además, resulta tedioso, no apropiado para un gran número de muestras e incapaz de discernir con facilidad cuando el eritrocito está invadido por A. marginale o por A. centrale (Visser & Ambrosio, 1987). El resultado de tinción puede ser influido por diferentes factores como el valor de pH de la solución, el tiempo de tinción y la fijación (Especialidades Diagnósticas IHR Ltda., 2007). 1.4.3.1.1.2 Tinción con naranja de acridina-bromuro de etidio La tinción naranja de acridina-bromuro de etidio es una técnica que consiste en el uso de dos fluorocromos combinados: El bromuro de etidio se une a las bases del ADN de la bacteria, mientras que el colorante naranja de acridina ofrece un mejor contraste entre la bacteria y el material de fondo y tiñe la membrana del eritrocito, permitiendo diferenciar las células sanguíneas en el campo visual, aumentando de esta manera la especificidad, debido a que disminuye el rango de error originado por falso positivos, tal y como puede ocurrir con otras tinciones como Giemsa (Eleizalde, Caballero & Reyna-Bello, 2007). 17 La microscopía de fluorescencia utilizando naranja de acridina-bromuro de etidio se está usando en la actualidad ya que es un método más sensible, simple y relativamente económico para la detección de A. marginale (Caballero, 1993). 1.4.3.1.2 Técnicas moleculares 1.4.3.1.2.1 Hibridación de ácidos nucléicos Las pruebas basadas en los ácidos nucléicos para detectar A. marginale en ganado portador son de desarrollo reciente (Eriks et al., 1989; Figueroa et al., 1993b; Gale et al., 1996; Torioni de Echaide et al., 1998). Las sondas de ácidos nucléicos constituyen una prueba sensible y específica para el diagnóstico. La intensidad de la señal de hibridación obtenida se correlaciona con el número de parásitos, dando información del nivel de parasitemia (Barbet et al., 1986). En el diagnóstico de A. marginale se han utilizado sondas de ADN genómico y recombinantes, basadas en ADN o ARN, pero en ocasiones la limitada sensibilidad de la sonda no permite la detección de portadores sanos con niveles bajos de parasitemia (Corona et al., 2004). Se ha descrito una sonda radiactiva de ARN que detecta parasitemias tan bajas como 0,000025% (Eriks et al., 1989). Las garrapatas infectadas también se han identificado utilizando una sonda para ADN clonado (Goff et al., 1988). 1.4.3.1.2.2 PCR La reacción en cadena de la polimerasa es un poderoso método de síntesis in vitro de DNA que fue desarrollada por Kary Mullis a mediados de los años 80 (Cultek, 2008). El principio fundamental de PCR es la amplificación de un fragmento específico de ADN utilizando ADN polimerasas, y por medio de ciclos sucesivos de altas y bajas temperaturas alternadas (multiplicación exponencial), obtener una cantidad adecuada del producto, el cual puede ser visualizado por electroforesis. De esta manera, una sola 18 molécula puede generar más de un millón de copias de sí misma luego de 30 ciclos de replicación exponencial (230moléculas idénticas =1,073,741,824 moléculas) (Espinosa, 2007). Según el protocolo establecido por Caffer et al., 2007, los reactivos necesarios para realizar la PCR son: − Enzima ADN polimerasa: Se utiliza normalmente Taq polimerasa aislada de una bacteria termófila Thermus aquaticus, de ahí su nombre comercial, cuya temperatura óptima de extensión es 72ºC. Está enzima tiene una vida media de 40 minutos a 95ºC, de manera que puede soportar aproximadamente hasta 40 ciclos repetitivos de PCR. El rango habitual en cada ensayo es de 0.5 - 2.5 U de enzima. A baja concentración disminuye el rendimiento de la reacción y a altas concentraciones genera productos inespecíficos. − Buffer de enzima: Es necesario para la adecuada actividad enzimática. En general contiene Tris-HCl 20mM y 50mM KCl pH 8.3-8.9, aunque se puede modificar su composición para optimizar el rendimiento de la enzima. Debe mantener un pH alcalino a lo largo de la reacción ya que así se favorece la amplificación. − Cloruro de Magnesio: es cofactor de la enzima Taq polimerasa, afecta la hibridación entre cadenas de ADN tanto la interacción entre los “primers” y el ADN molde como la estabilidad del ADN doble cadena. Por consiguiente a altas concentraciones disminuye la especificidad y sensibilidad de la reacción y a bajas concentraciones disminuye la eficiencia de la reacción. Los rangos de concentración utilizados varían de acuerdo a cada protocolo, pero en la mayoría de ellos es 1 -3 mM. − Desoxirribonucléotidos trifosfato (dNTPs): son dATP, dCTP, dGTP y dTTP, deben ser agregados en iguales cantidades para minimizar falsas incorporaciones en la polimerización. Se utilizan generalmente a una concentración de 200µM. − Primers: llamados también oligonucleótidos, iniciadores, cebadores, “oligos”, etc., son secuencias específicas complementarias que se añaden a la reacción necesarios para que se inicie la transcripción, preferentemente tienen entre 15 a 30 pb de longitud. No deben ser complementarios entre sí y deben tener similar contenido de G+C. A altas 19 concentraciones disminuyen la especificidad de la reacción y a bajas concentraciones disminuyen la eficiencia de amplificación. El rango de concentración varía desde 0.3 a 1 µM. − ADN: la secuencia a amplificar debe contener desde < 0.1 a unas pocas kilobases. La cantidad total de ADN usado normalmente es de 0.05 a 1.0 µg. Lo que es realmente importante es la concentración molar del ADN, por lo que la cantidad a agregar depende del tamaño de las moléculas en el ADN molde. − Control negativo: se utiliza un tubo de reacción solo con reactivos, sin ADN molde. − Control positivo: se utiliza un ADN molde de una cepa patrón o donde el perfil a amplificar sea conocido en ella. El método se basa, en la realización de tres reacciones sucesivas llevadas a cabo a distintas temperaturas. Estas reacciones se repiten cíclicamente entre veinte y cuarenta veces (Figura 1.2.), y son: Desnaturalización: Comprende en la desnaturalización del DNA (se separan las dos hebras de las cuales está constituida), con el fin de que los primers puedan encontrar la secuencia específica para unirse. Usualmente se realiza a una temperatura entre los 94°C y 96°C por un tiempo aproximado de 0.5 a 2 minutos. La temperatura a la cual se decide realizar la desnaturalización depende, por ejemplo, de la proporción de G+C que tenga la hebra, como también del largo de la misma (OPS/OMS., 2002). Alineamiento o hibridación: Una vez desnaturalizado el DNA se producirá la hibridación de los primers, es decir, los primers se unirán a su secuencia complementaria para la cual fueron diseñados, con cara hacia el extremo terminal 5' de la fracción de DNA a amplificar, esto ocurre en ambas cadenas delimitando la secuencia de DNA blanco a ser amplificado. Esto se realiza a una temperatura comprendida entre los 50°C y 60°C por un tiempo aproximado de 0.5 a 2 minutos, para permitir que los primers se unan a las secuencias blanco buscadas (alineamiento). Los puentes de hidrógeno estables entre las 20 cadenas de ADN (unión ADN-ADN) sólo se forman cuando la secuencia del primer es muy similar a la secuencia del ADN molde. La polimerasa une el híbrido de la cadena molde y el primer, y empieza a sintetizar ADN. Los cebadores actuarán como límites de la región de la molécula que va a ser amplificada (OPS/OMS. 2002). Polimerización Elongación o Extensión: Después que los primers se han hibridado ocurre el proceso de extensión en el cual el protagonista es la ADN polimerasa que sintetiza una nueva hebra de ADN complementaria a la hebra molde añadiendo los dNTP's complementarios en dirección 5'→ 3', uniendo el grupo 5'- fosfato de los dNTPs con el grupo 3'- hidroxilo del final de la hebra de ADN creciente (la cual se extiende).Este proceso se lleva a cabo a una temperatura de 72°C por un tiempo de 2 minutos (OPS/OMS. 2002). De esta manera después de varios ciclos el producto predominante de la reacción será aquella pieza de DNA la cual está flanqueada por los primers e incluirá a los primers por sí mismos. Los ciclos de calentamiento y enfriamiento pueden ser repetidos y los fragmentos de DNA producidos continuarán acumulándose exponencialmente hasta que los productos de la reacción estén agotados o que la enzima sea incapaz de sintetizar bastante DNA con rapidez. Figura 1.2. Descripción del proceso de PCR en los primeros ciclos de reacción La técnica PCR es útil para confirmar la presencia de crónicos, cuando la serología no es concluyente. También es útil para evaluar la eficacia del tratamiento, antes de la desaparición de los anticuerpos. PCR resultan de gran valor para la identificación de patógenos de vectores método ha sido utilizado para la identificación de garrapatas infectadas con el aislamiento 21 Kornblihtt, 1993). Anaplasma spp La sensibilidad y especificidad del (Satz & , en portadores artrópodos. Este 22 Virginia de A. marginale, usando cebadores diseñados a partir de la secuencia nucleotídica del gen msp1b del aislamiento Florida (Stich et al., 1991). Palmer et al., (1998), caracterizaron la infección persistente de A. marginale en ovejas utilizando PCR (gen msp5), observando un patrón de persistencia similar al del ganado bovino. Figueroa et al. , (1993) desarrollaron una PCR múltiple para la detección de B. bovis, B. bigemina y A. marginale a partir de sangre periférica de bovino, con buenos resultados. Torioni et al., (1998), optimizaron una PCR “nested”, acoplado con análisis de secuencia e hibridación para identificar el gen msp5 de A. marginale, siendo capaz de detectar hasta 30 eritrocitos infectados por mililitro de sangre, lo cual lo hace de 10-100 veces más sensible que la PCR previamente descritos, sondas de ARN y ensayos de hibridación (Eriks et al., 1989; French et al., 1998; Gale et al., 1996 & Ge et al., 1997). 1.4.3.2 Métodos indirectos 1.4.3.2.1 Métodos serológicos 1.4.3.2.1.1 Ensayo inmunoenzimático (ELISA) La técnica de ELISA es un ensayo inmunoenzimático descrita por Engvall y Perlman en 1971, que permite la determinación de antígenos (Ag) o anticuerpos (Ac) a partir de fluidos biológicos principalmente suero sanguíneo (Ruiz & Martínez, 2000). Este inmunoensayo está basado en la habilidad del Ac o Ag de adsorberse a un soporte de fase sólida, manteniendo su actividad inmunológica, unirse a una enzima y que el complejo antígeno o anticuerpo-enzima conserven tanto su actividad inmunológica como su actividad enzimática (Guzmán, 2005). 23 Para realizar el ensayo es preciso disponer de una preparación pura de un Ac o Ag o de ambos. El Ag o Ac se acopla a un soporte sólido (placas de poliestireno), que absorberá una cierta cantidad de la proteína; y es reconocido por el Ag o Ac existente en el suero sanguíneo, está reacción antígeno-anticuerpo es revelada por un conjugado que está constituido por un Ac, marcado con una enzima; posteriormente se adiciona el sustrato específico que, en contacto con la enzima, producirá un color observable a simple vista y cuantificable por un lector de placas de ELISA (Ruiz & Martínez, 2000). Los componentes de la técnica de ELISA son: - Soporte sólido: se puede utilizar: nitrocelulosa, vidrio, celulosa, poliacrilamida, papel o dextrán, plástico como poliestireno. - Conjugado: marcador que permite revelar la reacción Ag – Ac, es constituido por el Ac conjugado o marcado con una enzima. La enzima utilizada debe ser estable, fácil de conjugar, fácil de detectar y de bajo costo. Las enzimas más utilizadas son la fosfatasa alcalina, la peroxidasa y la b-D-galactosidasa. - Substrato: El substrato utilizado debe producir una reacción con un producto coloreado fácilmente medible, también debe ser estable y de bajo costo. Para la enzima peroxidasa se utiliza el substrato o-fenilendiamina (OPD) y para la enzima fosfatasa alcalina, el substrato más utilizado es el p-nitrofenilfosfato (pNPP). - Solución de parada: Se utiliza para detener la reacción, los más utilizados son HCl, H2SO4, NaOH, H2O, dependiendo del tipo de enzima utilizada en el conjugado. Los métodos de ELISA dependiendo de la actividad enzimática se dividen en dos tipos: - Competitivos - No competitivos: dentro de estos tenemos: • Los directos que detectan antígenos • Los indirectos que detectan anticuerpos. 24 1.4.3.2.1.1.1 ELISA competitivo El ELISA competitivo tiene por objetivo determinar la concentración de Ag o Ac, en el caso de la determinación de Ac, se basa en la competencia que se establece entre el anticuerpo de la muestra y el conjugado para ocupar sitios reactivos en el antígeno fijado. En este ELISA (Figura 1.3.) tanto la muestra que contiene el anticuerpo como el conjugado (anticuerpo ligado a una enzima) se agrega al mismo tiempo. Si la concentración de anticuerpos en la muestra es alta muy poco conjugado puede fijarse en los antígenos inmovilizados, por lo tanto habrá ausencia de coloración por la poca fijación de la enzima con el sustrato. Inversamente con muestras que contienen poco o nada de anticuerpos, más conjugado se fijará al antígeno y la posterior adición de sustrato producirá la presencia de color (Docstoc, 2009). Figura 1.3. Principio de la prueba de ELISA tipo competitivo (Docstoc, 2009). Conjugado y muestras agregados simultaneamente Conjugado Anticuerpo presente en el suero Sustrato Anticuerpo del paciente Conjugado Produce poca o ninguna coloración RESULTADO REACTIVO Produce coloración RESULTADO NO REACTIVO 25 El establecimiento de un ensayo de ELISA competitivo, utilizando la proteína recombinante MSP5, permitió el incremento de la sensibilidad a un 96 % y la especificidad de un 95 %, pudiendo detectar las infecciones persistentes del parásito (Torioni de Echaide et al., 1998) En el año 2000 se desarrolló un ELISA comercial para la detección de anticuerpos contra A. marginale y A. centrale en Australia y Zimbabwe. En Australia la sensibilidad y especificidad fue de 100 % y 83.3 %, respectivamente y en Zimbabwe se mostró una sensibilidad de un 100 %, no se pudo calcular la especificidad por la poca cantidad de sueros positivos con que contaban (Bowles et al., 2000). 1.4.3.2.1.1.2 ELISA no competitivo 1.4.3.2.1.1.2.1 ELISA Directo Esta prueba es generalmente de tipo sándwich (Figura 1.4.), permite la detección de antígenos, consiste en ligar un anticuerpo monoclonal a una fase sólida (pocillo, esfera plástica) el cual capta al antígeno presente en el suero. A continuación se agrega el conjugado (Ac policlonal marcado con una enzima) y se promueve el desarrollo de color tras la adición de substrato. Figura 1.4. Principio de la prueba de ELISA tipo sándwich (Bouchard, 2009). 26 Un ensayo inmunoenzimático (ELISA) fue desarrollado para detectar Ac contra A. marginale usando un Ag parcialmente soluble preparado a partir de los cuerpos iniciales de eritrocitos semipurificados con parasitemia 80,0%. Esta técnica utilizó la fosfatasa alcalina y p-nitrofenil fosfato como indicadores de la respuesta. La alta sensibilidad (100,0%) se confirmó con los sueros de 100 terneros infectados experimentalmente con A. marginale. La alta especificidad (94,0%) fue confirmada por el bajo porcentaje de reacciones cruzadas con sueros de animales infectados experimentalmente con Babesia bigemina y Babesia bovis (1,4 y 6,6% respectivamente) (Madruga et al., 2000). Se desarrolló una prueba ELISA para detectar Ac, utilizando anticuerpos monoclonales para epítopes conservados de la proteína de superficie MSP1, que logró discriminar entre anaplasmosis y otras enfermedades hemoparasíticas clínicamente similares, sin embargo la sensibilidad de este ensayo no fue mayor de 0.01 (1,1% de parasitemia), por lo que la prueba no resultó idónea para la detección de portadores (Trueblood et al., 1991). Se utilizo está técnica para la detección de Ac contra A. marginale en bovinos de un sector de Venezuela, considerado como potencial productores de carne con fines de exportación hacia el mercado internacional, se escogieron al azar 400 bovinos tomando en cuenta el tipo de ganadería y la edad de los animales, los resultados obtenidos indicaron una prevalencia total 31,8% (González & Meléndez, 2007). 1.4.3.2.1.1.2.2 ELISA Indirecto Se basa en la fijación de un antígeno en la fase sólida (Figura 1.5.), el cual atrapa los Ac de la muestra sanguínea que posteriormente son identificados por el conjugado, que al reaccionar con el sustrato dará la reacción de color. En estos casos la cantidad de Ac es directamente proporcional a la cantidad de producto enzimático formado, por lo cual se 27 produce más color a medida que la concentración de Ac aumenta en la muestra dando lecturas de densidad óptica altas y viceversa (Docstoc. 2009). Figura 1.5. Principio de la prueba de ELISA indirecto (Docstoc. 2009). Para la detección de sueros positivos frente a A. marginale se ha diseñado un método iELISA, basado en la utilización de dos preparaciones de Ag, una “negativa” de Ag normal de eritrocitos y de una “positiva” de Ag derivados de eritrocitos infectados por A. marginale, Aunque este método es más lento que las otras pruebas que utilizan un solo Ag, esta prueba reduce notablemente las reacciones cruzadas que son el resultado de isoantígenos. La prueba identificó correctamente los 100 sueros positivos conocidos tomados de ganado bovino hasta después de 3 años de la infección, mientras que el 3% de sueros negativos, el 2% de sueros de Babesia bovis y el 4% de sueros de B. bigemina dieron falsos resultados positivos (Duzgun et al., 1988). Reyna-Bello et al., (1998) desarrollaron un ensayo ELISA para el diagnóstico de la anaplasmosis bovina con la proteína MSP5 de A. marginale. El ELISA desarrollado con sueros de campo de diferentes regiones geográficas de Venezuela mostró una prevalencia de la enfermedad de un 47%, lo que coincidió con los resultados de los estudios epidemiológicos realizados. 28 1.4.3.2.1.2 Inmunofluorescencia indirecta (IFI) La Inmunofluorescencia indirecta ha sido utilizada para el diagnóstico de anaplasmosis, consiste en detectar inmunoglobulinas del suero bovino, por intermedio de dos reacciones: con la bacteria y con la globulina antibovina teñida con fluoresceína (IICA, 1989). Frecuentemente se ha considerado una prueba sensible, sin embargo, por sus características en ocasiones se considera no útil, pues pueden ocurrir reacciones falsas positivas, que se atribuyen al largo período de incubación de esta enfermedad (Kroon et al., 1990). Esta prueba permite la visualización de reacciones Ag-Ac por medio de marcaje de una inmunoglobulina con fluorocromos. Estás son sustancias con capacidad de absorción de energía luminosa, tornándose excitadas por un breve periodo de tiempo (10-9 a 10-7 segundos) y enseguida emitiendo en forma de fluorescencia al retornar en su estado normal. (Madruga et al., 2001). McGuire et al., en 1984 reportaron una IFI, donde se usa como Ag una muestra cruda de A. marginale, contaminado con membranas eritrocitarias, dando una serie de resultados falsos-positivos y falsos-negativos en el ganado infectado agudamente y en el convaleciente; en el ganado persistentemente infectado pudo evidenciarse un alto porcentaje de falsos negativos. (Goff et al., 1988; Montenegro-James et al., 1985). Así mismo la IFI ha sido utilizada para estudios epidemiológicos (Duzgun et al., 1988). Todos estos ensayos para la detección de Ac utilizan Ag crudos obtenidos de A. marginale parcialmente purificados, lo que provoca que disminuya la sensibilidad y especificidad de la técnica y lo haga menos eficaz (Montenegro-James et al., 1985), dando una serie de reacciones falsos positivos y falsos negativas, provocadas en algunos casos por la baja sensibilidad del método (McGuire et al., 1979). 29 1.4.4 Control de la enfermedad A pesar de la severidad de las pérdidas y de la amplia distribución de la enfermedad, no se ha logrado el control de esta, sobre una base sostenible; hasta la fecha no se cuenta con un procedimiento efectivo para el control en muchas áreas, a pesar del incremento de los portadores, animales susceptibles, vectores de transmisión y de las cuantiosas pérdidas económicas que provoca. Las medidas de control para la anaplasmosis no han cambiando marcadamente durante los últimos 50 años e incluyen el control de los artrópodos vectores mediante la aplicación de acaricidas, la quimioprofilaxis y la vacunación (Corona et al., 2004). La aplicación de acaricidas para eliminar el transmisor la garrapata, no es factible para muchos productores, por su elevado costo y su prolongado uso, crea una población de ganado susceptible, cuando se interrumpe la aplicación del acaricida y ocurre la resistencia a las garrapatas. La vacuna recombinante Gavac permite una significativa mejora en el control de las poblaciones de garrapatas Boophilus microplus, en condiciones de campo, pero no tiene efecto para otras especies como Amblioma spp, también transmisoras de Anaplasmosis (Ortiz, Corona, & Martínez, 2000). La vacunación contempla el uso de cepas vivas atenuadas sean de A. marginale o A. centrale, considerada estás últimas como de menor virulencia. La vacunación con este tipo de cepas, particularmente las de A. centrale, aunque ha sido muy exitosa, dependerá en gran medida de una supervisión gubernamental estricta. El uso de agentes vivos conlleva también el riesgo de transmisión de otros patógenos que pueden traer graves consecuencias a programas de control y/o erradicación a nivel nacional (Rodríguez et al., 2003). 1.5 Sistema de hipótesis La prevalencia de anaplasmosis en el ganado faenado en la Empresa metropolitana de Rastro de Quito (EMRQ) presenta variación significativa en relación a las prevalencias reportadas en estudios de campo en la costa del Ecuador. 30 CAPÍTULO 2: MATERIALES Y MÉTODOS 2.1 Participantes La presente tesis fue desarrollada como parte del proyecto de extensión 2008 “Determinación de la prevalencia e identificación de las principales especies de garrapatas y de las enfermedades que estas transmiten, en el ganado bovino faenado en la Empresa Metropolitana de Rastro de Quito”, con fondos internos para docencia de los laboratorio de Biotecnología de la ESPE. La Empresa Metropolitana de Rastro de Quito (EMRQ) proporcionó su planta central (Camal Metropolitano) para la toma de muestras de sangre de bovinos faenados. La Universidad Simón Rodríguez (Venezuela) con la colaboración del Dr. Armando Reyna proporcionó el control positivo de ADN de A. marginale. En los Laboratorios de Biotecnología Humana y Animal de la ESPE se realizó el procesamiento de muestras sanguíneas, la técnica de microscopía de frotis sanguíneo, la extracción de ADN y la PCR. En los laboratorios Zurita&Zurita se realizó el cELISA. 31 2.2 Lugar o zona de estudio 2.2.1 Trabajo de Campo La presente investigación se realizó en la planta central de la EMRQ, en la cual se realiza el faenamiento de los bovinos procedentes de la sierra, costa y oriente ecuatoriano, ubicada en la Ciudadela la Ecuatoriana de la ciudad de Quito, provincia de Pichincha. Se tomaron muestras de sangre de los bovinos faenados y se recogió información general de cada animal como: edad, sexo y procedencia, cuyos datos serán evaluados como las variables dependientes de la presencia o ausencia de la enfermedad. 2.2.2 Trabajo de Laboratorio El trabajo de laboratorio se llevó a cabo en los laboratorios de Biotecnología en el área de Biotecnología Animal de la Escuela Politécnica del Ejército (ESPE), ubicados en Av. Progreso S/N, de la cuidad de Sangolquí, cantón Rumiñahui, provincia de Pichincha. 2.3 Periodo de tiempo de la investigación La investigación tuvo un período de duración de 1 año y 4 meses, la fecha de inicio fue el 4 de mayo del 2009 y la fecha de terminación fue el 1 de agosto del 2010. 2.4 Diseño estadístico Para el diseño estadístico se estableció un muestreo aleatorio simple (MAS), además se realizó el cálculo de criterios de fiabilidad como sensibilidad, especificidad y otros conceptos relacionados. 32 2.4.1 Diseño Muestral (MAS) 2.4.1.1 Datos Para la realización del diseño muestral se requirió de la siguiente información: - Número de días de faenamiento por semana = 3 (lunes, miércoles y viernes) - Período de muestreo (días) = 90 - Días de toma de muestra = 39 - Horas de faenamiento: El faenamiento de los bovinos tiene un horario que empieza a las 5H00 am y termina a las 13H00 pm., pero la hora de finalización del faenamiento puede variar según la cantidad de ganado que ingrese al camal Metropolitano. El muestreo para este proyecto se realizará en el horario de 8H00 am a 12H00 pm. (4 horas), debido a que el transporte no estaba disponible para ese horario. - Faenamientos anual de ganado bovino = (Tabla 2.1.), estos datos sirvieron para obtener el número de bovinos faenados del año 2009. Tabla 2.1. Faenamiento bovino comparativo anual (1996-2008) de la Empresa Metropolitana de Rastro de Quito (EMRQ). Año Faenamiento 1996 55278 1997 54751 1998 52228 1999 58251 2000 52579 2001 54461 2002 58392 2003 62107 2004 64392 2005 66708 2006 65211 2007 64833 2008 66745 33 2.4.1.2 Cálculos Con estos datos se obtuvo la ecuación de la recta (y=ax+b), realizando una regresión lineal (Figura 2.1.) Figura 2.1. Faenamiento bovino comparativo anual – Empresa Metropolitana de Rastro de Quito (EMRQ). El faenamiento bovino aproximado del año 2009 se obtuvo remplazando los datos, en la ecuación 1.  =  +   = 1251,6 − 2445969,6 ó 1.  = 1251,576923  = −2445969,615 Donde: a = (pendiente) es la tasa media de incremento anual b= (corte) y = 1251,6x - 2445969,6 R2 = 78,08% 50000 52000 54000 56000 58000 60000 62000 64000 66000 68000 70000 1994 1996 1998 2000 2002 2004 2006 2008 2010 bo v in o s fa en a do s años Faenamiento bovino comparativo anual 34 Con estos datos obtenemos los siguientes valores: - Faenamiento bovino aproximado año 2009 = 68448 - Faenamiento mensual de ganado bovino (FM) = 5704 - Faenamiento trimestral (N) = 17112 tamaño poblacional 2.4.1.3 Estimación de la muestra El tamaño de la muestra se estimó con la ecuación 2:  =  ∝    1 − ! + "# " + ∝    1 − ! ó 2. Donde: n = Tamaño muestral requerido para estimar pi en un MAS (muestreo aleatorio simple) N = Tamaño poblacional (faenamiento trimestral) zα/2=Percentil 1-α/2 de la ley normal estándar pi = proporción del ganado faenado en el EMRQ q presentan anaplasmosis es decir, prevalencia poblacional del la enfermedad p = prevalencia muestral E= Error Máxima diferencia aceptable entre p y pi. 2.4.1.3.1 Datos − N = 17112 − E = 5,00% − NDC = 95,00% − NDS = 5,00% − zα/2 = 1,959963985 − p = 50,00%  ESTIMACIÓN q maximiza la varianza debido a que no se dispone de un estudio previo 35 Donde: NDC = Nivel de confianza (1-α) Probabilidad de que pi se encuentre en el IDC (intervalo de confianza) NDS = Nivel de significación (α) Probabilidad de rechazar una hipótesis nula (H0) sobre pi, cuando esta es verdadera. 2.4.1.3.2 Cálculos - Tamaño muestral (n) = 377 - Numero de bovinos por día = 377/39 =10 (su utilizó una fórmula REDONDEAR .MAS) - Número de bovinos por hora = 10 /4 = 2,5 - Tamaño muestral ajustado (n*) = 39*10 = 390 2.4.1.4 Estrategia diaria para la toma de muestra en los bovinos Para la toma de muestras de los bovinos faenados se realizó una estrategia diaria para la toma de las muestras. (Tabla 2.2) Tabla 2.2. Estrategia diaria para la toma de muestras de los bovinos faenados en la Empresa Metropolitana de Rastro de Quito (EMRQ). Horas de faenamiento (muestreo) No. de bovinos muestreados 8H00 am a 9H00 am 3 9H00 am a 10H00 am 2 10H00 am a 11H00 am 2 11H00 am a 12H00 pm 3 Total 10 36 Para esta investigación se estimó un total de 377 muestras sanguíneas de bovinos en los tres meses, pero según los días de muestreo (39) y el número de muestras que se debían tomar por día (10), el tamaño muestral ajustado fue de 390 bovinos. Debido a problemas de presupuesto para la adquisición de reactivos, se realizó un submuestreo de 181 bovinos para la realización de las pruebas diagnósticas. 2.5 Procedimientos 2.5.1 Fase de Campo 2.5.1.1 Recolección, procesamiento y conservación de muestras de sangre Las muestras sanguíneas de los bovinos fueron recolectadas en frascos de vidrio estériles y en tubos con anticoagulante-EDTA (4 mL), durante el proceso de faenamiento (Anexo A), en la etapa de sangrado, que consiste en el seccionamiento transversal del paquete vascular a nivel del cuello para producir un sangrado profuso. La sangre recolectada en los frascos de vidrio fue centrifugada a 3500 rpm por 10 minutos para la obtención del suero, el cual fue almacenado a -20° C. Los sueros fueron analizados posteriormente mediante la prueba cELISA. La sangre de los tubos vacutainer con anticoagulante se utilizó para realizar el frotis de capa fina y después fue congelada a - 80ºC para posteriormente realizar la extracción de ADN. 2.5.2 Fase de Laboratorio 2.5.2.1 Microscopía de frotis sanguíneos con tinción Giemsa Está técnica está constituida por varios procedimientos, los cuales están basados en el protocolo de Brandt, 2004. 37 2.5.2.1.1 Frotis sanguíneo de capa fina Materiales y reactivos - Porta objetos - Palillos de dientes - Pipetas pasteur - Metanol 100% Procedimiento - Antes de realizar el frotis sanguíneo se remojaron los portaobjetos durante varias horas en metanol puro y se dejó secar al ambiente. - Sobre el portaobjeto limpio se colocó en un extremo con un palillo de dientes una gota pequeña de sangre y utilizando el borde de otro portaobjetos se realizó la extensión con firmeza de la gota de sangre conservando un ángulo de 45° respecto al portaobjetos horizontal, así se obtuvo una película fina de sangre. Luego se dejó secar el extendido al ambiente. - Posteriormente con una pipeta pasteur se colocó unas gotas de metanol 100% hasta cubrir todo el extendido, se dejó actuar por 3-5 minutos para que se evapore el alcohol y se fije la muestra. Se dejó secar completamente al ambiente. 2.5.2.1.2 Preparación de los reactivos para la tinción Giemsa Materiales y reactivos - Na2HPO4 anh - Na2H2PO4.H2O - Agua destilada - Colorante Giemsa 38 Procedimiento Para realizar la tinción de Giemsa se necesitó preparar la Buffer pH 7,2 que consta de Stock A y Stock B y la solución diluida de Giemsa, la cantidad y los reactivos necesarios para preparar estas soluciones se detalla en el cuadro 2.1. Cuadro 2.1. Reactivos necesarios para la tinción Giemsa 2.5.2.1.3 Tinción de Giemsa Procedimiento − Con una pipeta pasteur se colocó unas gotas de solución diluida de Giemsa hasta cubrir todo el portaobjeto previamente fijado y secado durante 25 minutos. − Luego se lavaron los portaobjetos con agua destilada y se dejó secar al ambiente. Reactivo Cantidad Na2HPO4 anh 9,47 g Agua destilada 1L Na2H2PO4.H2O 10,48 g Agua destilada 1L Stock A 61 mL Stock B 29 mL Agua destilada 1L Colorante de Giemsa 1 gota Buffer pH 7,2 1 mL Stock A Stock B Buffer pH 7,2 Solución diluída de Giemsa 39 − Los frotis coloreados se examinaron utilizando un microscopio de luz con objetivo de inmersión 100X. Cada placa se observó por un periodo de 10 minutos (50 campos diferentes aproximadamente), haciendo énfasis en las áreas más delgadas del frotis. La placa se consideró negativa cuando no se encontró la rickettsia después de 10 minutos de observación. 2.5.2.2 PCR Esta técnica diagnóstica se realizó en colaboración con el Laboratorio de Biotecnología Humana de la ESPE. La extracción de ADN de los bovinos muestreados se realizó por este laboratorio. Para la optimización del sistema de PCR se basó en el protocolo establecido en el paper: Multiplex polymerase chain reaction based assay for the detection of Babesia bigemina, Babesia bovis and Anaplasma marginale DNA in bovine blood de Figueroa et al., (1993b). Materiales y reactivos - El ADN que se utilizó como control positivo de A. marginale fue proporcionado por la Universidad Simón Rodríguez (Venezuela), gracias a la ayuda del Dr. Armando Reina DMV Ph.D. - Para la amplificación de una región del gen MPS5 de 200 pb se utilizaron un par de primers Am9 y Am10 de 20 y 22 pares de bases respectivamente, publicados por Figueroa et al., 1993b. (Tabla 2.3.) Los primers fueron producidos por Invitrogen. - Los demás reactivos están detallados en Cuadro 2.2. Tabla 2.3. Primer utilizados para la amplificación de un fragmento de 200 pares de bases del gen MPS5 de Anaplasma marginale Primers Secuencia (5' -3') Tm (°C) %GC Am9 TTGAAGGTTGAAGTGCAGGT 51.69 45.00 Am10 CCATATCGGAATGCACCAAAAC 52.53 45.45 40 Procedimiento La PCR se llevó a cabo con dos volúmenes finales de 50 y 30 µL por reacción. En los ensayos preliminares se utilizó una Taq polimerasa (Invitrogen), después se uso una Taq polimerasa (Promega) y se utilizó un volumen final de 30 µL por reacción. El ADN se adicionó al final en un volumen final de 5 y 3 µL respectivamente. Para el control positivo se utilizó una dilución 1:25 del ADN proveniente de Venezuela. Para el control negativo se reemplazó el ADN por 5 µL de agua grado PCR (Cuadro 2.2.). Cuadro 2.2. Master mix necesaria para la PCR Las condiciones para la amplificación se basan en una PCR, utilizando un termociclador marca ESCO. Las condiciones para la amplificación se especifican en el Cuadro 2.3. Los fragmentos amplificados se observan mediante electroforesis en geles de agarosa al 2% (Anexo B). Invitrogen Promega Invitrogen Promega Invitrogen Promega Am9 0,3 0,3 Am10 0,3 0,3 dNTP´s 1 0,6 MgCl2 50 mM 25 mM 1,5 1,8 Buffer 10X 5X 5 6 Sulfato --- 25 mM --- 3 Mm --- 3,6 Agua grado PCR 36,4 14,15 Taq Polimerasa 2,5 U/µL 1,5 U/µL 0,5 0,25 Volumen total 45 27 Reactivos 20 mM 0,4 mM 1X (µL) 5 U/µL --- 1X 1,5 mM Cinicial Cfinal 100 pmoles 30 pmoles 100 pmoles 30 pmoles 41 Cuadro 2.3. Condiciones para la amplificación del gen MPS5 de Anaplasma marginale 2.5.2.2.1 Cuantificación del ADN (control positivo) por fluorometría Para cuantificar el ADN por el método de cuantificación por fluorometría, se utilizó el fluorómetro Qubit™ de Invitrogen y Quant-iT ™ dsDNA HS Assay Kit, que consta de un flourómetro, una buffer de dilución y dos estándares de calibración. - Para realizar la cuantificación de ADN se preparó la solución de trabajo, solución estándar 1 y la solución estándar 2, la cantidad y los reactivos necesarios para preparar estas soluciones se detalla en el cuadro 2.4. Cada solución preparada se mezcló en un vortex por 3 minutos. Cuadro 2.4. Reactivos necesarios para la cuantificación de ADN. No. de ciclos Proceso Temperatura (°C) Tiempo 1 Denaturación inicial 96 4 min 35 Denaturación 96 30 s 35 Alineamiento 61 30 s 35 Extensión 72 30 s 1 Extensión final 72 4 min 1 Detener la reacción 4 10 min Reactivo Cantidad Quant-iT™ dsDNA HS (fluoróforo) 1 µL Buffer de dilución Quant-iT™ dsDNA HS 199 µL Solución de trabajo 190 µL Estandar de calibración 1 10 µL Solución de trabajo 190 µL Estandar de calibración 2 10 µL Solución de trabajo Solución estándar 1 Solución estándar 2 42 - Hay que tener en cuenta que solución de trabajo (200µL) es por cada muestra que se quiere cuantificar, además de los dos estándares de calibración. - Se preparó las muestras a cuantificarse añadiendo 1µL de ADN con 199 µL de solución de trabajo, se mezcló en un vortex por tres minutos e incubó por dos minutos a temperatura ambiente tanto los estándares como las muestras. - Pasado el tiempo de incubación se insertó los tubos en el fluorómetro, primero se leyó los estándares y luego las muestras, tres lecturas por muestra. - Se registró las lecturas de las muestras dada por el fluorómetro Qubit ™. - Con los datos obtenidos (concentración en ng/mL) se calculó la concentración original de la muestra de ADN en ng/µL, con la ecuación 3. Concentración -./0123 = x567 8 99:×<999= Ecuación 3. Donde: QF = valor dado por el fluorómetro Qubit ™ x = el número de microlitros de muestra de ADN 2.5.2.2.2 Optimización del Sistema de PCR Para optimizar el sistema de PCR se realizaron ensayos de gradiente de temperatura y adición de adyuvantes. En el primer ensayo se utilizó un gradiente de temperaturas de 55, 57, 59, 61, 63 °C con un volumen de reacción de 50 µL con 2,5 U de Taq Polimerasa 5U/µL (Invitrogen). Para el ensayo de adyuvantes se utilizaron Glicerol 5%, Albúmina sérica bovina (BSA) 0,8µg/µL y Sulfato de Amonio 3mM, se llevó a cabo con un volumen de reacción de 30 µL con 1,25 U de Taq Polimerasa 5U/µL (Promega). 43 2.5.2.2.3 Determinación de la sensibilidad analítica Para determinar el límite de detección del ensayo de PCR medido en ng/µL de ADN, se realizaron diluciones seriadas del ADN (control positivo) con agua grado PCR (Figura 2.2.) y 3 µL y 5µL de cada dilución fue utilizada en la PCR. Los resultados se visualizaron mediante electroforesis en geles de agarosa al 2 %. Figura 2.2. Diluciones seriadas del ADN de Anaplasma marginale (control positivo) 2.5.2.2.4 Procesamiento de las muestras Después de optimizar el sistema de PCR, se procesó 181 muestras de bovinos, las 43 primeras muestras fueron procesadas con un volumen de reacción de 50 µL y las 138 muestras restantes con un volumen de reacción de 30 µL, las condiciones para la amplificación fueron las mismas (Cuadro 2.4.). 2.5.2.3 cELISA Para la realización de la prueba de ELISA se utilizó el Anaplasma Antibody Test Kit, cELISA., de la casa comercial Veterinary Medical Research & Development (VRMD. Inc) en Estados Unidos, catálogo No.: 282-2. 44 Este kit es un ensayo inmunoenzimático competitivo para la detección de anticuerpos específicos para Anaplasma en muestras de suero bovino. El principio de la prueba es el siguiente: los anticuerpos de la muestra de suero para Anaplasma inhiben la unión del anticuerpo monoclonal marcado con peroxidasa de rábano con el antígeno de Anaplasma que cubre los pocillos de plástico. La unión o la falta de unión del anticuerpo monoclonal conjugado marcado con peroxidasa de rábano se detecta mediante la adición del sustrato de la enzima, y se cuantifica por el color posterior del producto (VMRD, 2009). El desarrollo del color fuerte indica poca o ninguna obstrucción del anticuerpo monoclonal marcado con peroxidasa de rábano y, por tanto, la ausencia de anticuerpos contra Anaplasma en la muestra de suero. El desarrollo del color débil o nulo debido a la inhibición de la unión del anticuerpo monoclonal al antígeno de la fase sólida indica la presencia de anticuerpos de Anaplasma en la muestra de suero (VMRD, 2009). Materiales y reactivos - Componentes del kit Placas de microtitulación con 96 pocillos recubiertos con el antígeno rMSP5 marca VMRD. Inc. Placas de adsorción/transferencia con 96 pocillos recubiertos para la adsorción de suero y reducción de la unión de fondo marca VMRD. Inc. Control positivo Control negativo Conjugado anticuerpo-peroxidasa 100X Buffers de dilución de conjugado Solución concentrada de lavado 10X Solución de sustrato Solución para parar la reacción Equipos: - Pipetas Multicanal modelo SealPette™, marcan Jencons 50-250 µL 45 - Lector sencillo de micro-ELISA, marca HUMAN - Lavador manual de tiras y pocillos modelo 3100 marca Stat Wash® 2.5.2.3.1 Preparación de los reactivos para la prueba de cELISA Para realizar la prueba se necesitó preparar el conjugado Mab/peroxidasa 1X y una solución de lavado 1X, la cantidad y los reactivos necesarios para preparar estas soluciones se detalla en el cuadro 2.5. Cuadro 2.5. Reactivos necesarios para la prueba de cELISA Del conjugado Mab/peroxidasa 1X, por pocillo se necesitó 50 µL, para 96 pocillos que contiene la placa se preparó aproximadamente 6 mL, de la solución de lavado 1X, por pocillo se necesitó aproximadamente 1,5 mL, para 96 pocillos que contiene la placa se preparó aproximadamente 150 mL. Siempre hay que tener en cuenta una cantidad adicional. 2.5.2.3.2 Etapas del cELISA − Los reactivos del kit deben estar a temperatura ambiente al igual que las muestras de suero a analizar. Reactivo Cantidad Conjugado Mab/peroxidasa 100X 60 µL Buffer de dilución de conjugado 5,940 mL Solución de lavado 10X 15 mL Agua destilada 135mL Conjugado Mab/peroxidasa 1X Solución de lavado 1X 46 − De cada uno de los sueros control positivo y control negativo y sueros a ser analizados (sueros problema) se recolectaron 70 µL y se añadieron en los pocillos de la placa de absorción/transferencia, el control positivo se añadió por duplicado y el control negativo por triplicado, y se llevó a incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente (21-25 °C) En la (tabla 2.4.) se presenta una descripción sistemática del procedimiento de cELISA. Tabla 2.4. Descripción sistemática del procedimiento de cELISA − La lectura se realizó en el lector de micro-ELISA a 630 nm. 2.5.2.3.3 Validación de la prueba de cELISA. 2.5.2.3.3.1 Parámetros de validación proporcionados por el kit de cELISA Los parámetros de validación de está técnica son: - La >? O.D. control negativo debe estar entre 0.40 y 2.10 - El porcentaje de inhibición del control positivo debe ser ≥ 30%. ETAPA PRODUCTO VOLUMEN/CÚPULA INCUBACIÓN Transferencia del suero Sueros de la placa de absorción/transferencia previa incubación 50 µL 60 minutos a 21-25 °C sin agitación Lavado 2 veces * Solución de lavado 1X 250 µL c/lavado no Adición del Conjugado Conjugado Mab/peroxidasa 1X 50 µL 20 minutos a 21-25 °C sin agitación Lavado 4 veces * Solución de lavado 1X 250 µL c/lavado no Adición del Sustrato Solución de sustrato 50 µL 20 minutos a 21-25 °C sin agitación, con obscuridad, evitar la luz directa Finalización de la reacción Solución de parada 50 µL no * La etapa de lavado se llevó a cabo con un lavador manual de tiras y posillos, despues de cada lavado se golpeó ligeramente las placas en una capa de papel fino hasta que visualmente no se dejó ninguna burbuja del líquido o de aire en los pocillos 47 2.5.2.3.3.2 Cálculo de parámetros de validación para el diagnóstico de A. marginale en muestras de suero de bovinos muestreados en la EMRQ Con las lecturas de la densidad óptica (D.O.) tanto del control positivo (añadido por duplicado) como del control negativo (añadido por triplicado) se procedió a calcular la media (@), del control negativo y el porcentaje de inhibición (% I) del control positivo. Estos valores fueron comparados con los proporcionadas por el kit, para la validación de está técnica. 2.5.2.3.4 Umbral de positividad e interpretación de los resultados El punto de corte para determinar si una muestra es positiva o negativa es de 30% de inhibición, este valor está predeterminado en el kit. Con los datos de D.O de cada muestra (Anexo C) se procedió a calcular el % I con la ecuación 4, tomando en cuenta la siguiente interpretación de resultados: − Las muestras con < 30% de inhibición son negativas − Las muestras con ≥ 30% de inhibición son positivas %I = 100 − D E.F.GHIJKLM: <99 :5 E.F.NOPKLOQ PIRMKSTOU Ecuación 4. Además también se pude interpretar los resultados según el color de reacción donde, - El desarrollo del color fuerte indica poca o ninguna obstrucción del Ac monoclonal marcado con peroxidasa de rábano y por tanto, la ausencia de Ac contra Anaplasma en la muestra de suero, revelando una muestra negativa. - El desarrollo del color débil o nulo indica inhibición de la unión del Ac monoclonal al Ag de la fase sólida y por tanto, la presencia de Ac de Anaplasma en la muestra de suero, revelando una muestra positiva. 48 2.5.2.4 Presencia de A. marginale en bovinos muestreados en la EMRQ según edad, sexo y procedencia-pruebas de independencia Para identificar relaciones de dependencia entre variables cualitativa (sexo, edad y procedencia) se utilizó un contraste estadístico basado en el estadístico χ2 (Chi-cuadrado), cuyo cálculo nos permitirá afirmar con un nivel de confianza estadístico de 5% si los niveles de una variable cualitativa influyen en los niveles de la otra variable nominal analizada (presencia o ausencia de A. marginale). El cálculo de χ2 se realizó con la ecuación 5. Ecuación 5. Donde: i = filas r = número de filas j = columnas c = número de columnas nij = frecuencias observadas fij = frecuencias esperadas teóricas 2.5.2.5 Comparación entre las pruebas diagnósticas 2.5.2.5.1 Criterios de fiabilidad El buen o mal desempeño de una prueba diagnóstica puede evaluarse a través del cálculo de su sensibilidad, especificidad, valor predictivo positivo, valor predictivo negativo y prevalencia. La estrategia recomendada para determinar la validez de una prueba diagnóstica, consiste en comparar los resultados de la prueba con los de un patrón de referencia (gold standard), que identifica el diagnóstico verdadero. ( ) ∑∑ = = − = r i c j ij ijij f fn 1 1 2 2χ 49 Para determinar los criterios de fiabilidad, se realizaron tablas de doble entrada, donde se compararon la microscopía de frotis sanguíneo y cELISA con respecto a la PCR. La PCR fue considerada como la técnica gold standard, la cual se destaca por su alta sensibilidad y especificidad (Elizalde et al., 2007; Torioni de Echaide et al., 1998), pudiendo detectar una rickettsemia de 10-6% (Torioni de Echaide et al., 1998), reduciendo significativamente la posibilidad de falsos positivos o negativos, lo que permitió una evaluación certera de las técnicas de microscopía de frotis y cELISA. Además se evaluó el porcentaje de concordancia, índice de kappa y coeficiente phi entre las técnicas. Sensibilidad: La sensibilidad de una prueba diagnóstica es la probabilidad de q bovino con anaplasmosis de un resultado positivo Sensibilidad = Pr (+ | D) Donde: Pr = probabilidad + = resultado positivo de la prueba diagnóstica | = división D = presencia de anaplasmosis Especificidad: La especificidad de una prueba diagnóstica es la probabilidad de que un bovino que no tiene la enfermedad (sano) de un resultado negativo o Especificidad = P (- | V?) Donde: V? = ausencia de anaplasmosis - = resultado negativo de la prueba diagnóstica 50 Valor predictivo positivo: El valor predictivo positivo (positive predictive value, PPV) es la probabilidad de que un bovino que da positivo tenga anaplasmosis. PPN = P ( D | + ) Valor predictivo negativo: El valor predictivo negativo (negative predictive value, PPV) es la probabilidad de que un bovino que da negativo no tenga anaplasmosis. NPV = P ( V? | −) Prevalencia de anaplasmosis: La prevalencia es la probabilidad de la enfermedad. Prevalencia = P (D) Para calcular la prevalencia de la enfermedad se tomó un registro para la determinación de datos zootécnicos (edad, sexo, raza), así como la procedencia aproximada de los animales muestreados. Con estos datos se pudo obtener la prevalencia según el sexo, edad y procedencia. 2.5.3 Recopilación de bibliográfica Para la recolección bibliográfica se visitó entidades públicas, privadas y universidades. 2.6 Análisis de datos Para el análisis de datos se tomó en cuenta el criterio de positividad, por el cual se consideran muestras positivas, a: 51 − Microscopía de frotis sanguíneos: las que se observa la o las rickettsias dentro del eritrocito, ubicadas en el margen del mismo. − PCR: en las que se observe la presencia de un fragmento de ADN de peso molecular esperado (200 pb) − cELISA: a las muestras cuyo porcentaje de inhibición sea ≥ 30%. 52 CAPÍTULO 3: RESULTADOS 3.1 Aspectos zootécnicos de los bovinos muestreados en la EMRQ Durante el periodo comprendido entre los meses de mayo y julio del año 2009 se muestrearon 181 bovinos, de los cuales se tomo información como: edad, sexo y procedencia (Anexo C). Del total de bovinos, el 77,35% (140/181) fueron machos y el 22.65% (41/181) hembras. La edad de los animales fue clasificada en tres grupos etarios: grupo I, animales entre 0 y 12 meses, grupo II, animales entre 13 y 36 meses, grupo III, animales mayores de 36 meses de edad. De acuerdo a esto, el 18,28% (33/181) de bovinos pertenecen al grupo I, el 50,28% (91/181) al grupo II y el 31,49% (57/181) al grupo III (Tabla 3.1.). Tabla 3.1. Distribución por edad y sexo de los bovinos muestreados en la Empresa Metropolitana de Rastro de Quito (EMRQ). Los bovinos muestreados provinieron de 7 provincias del Ecuador así: el 7,18% (13/181) de Cotopaxi, el 7,18% (13/181) de Esmeraldas, el 9,39% (17/181) de Manabí, el 11,05% (20/181) de Orellana, el 14.92% (27/181) de Pichincha, el 49,17% (89/181) de Santo Domingo de los Tsachilas y el 1,10% (2/81) de Sucumbios (Figura 3.1.). No Animales % 0- 12 33 18,23 13-36 91 50,28 > 36 57 31,49 Macho 140 77,35 Hembra 41 22,65 Edad (meses) Sexo Variables 53 Figura 3.1. Procedencia de los bovinos muestreados en la Empresa Metropolitana de Rastro de Quito (EMRQ). 3.2 Determinación de la presencia de A. marginale en la EMRQ Para determinar la presencia de A. marginale en muestras sanguíneas de 181 bovinos muestreados, se utilizó tres técnicas de diagnostico: Microscopía de frotis sanguíneo, PCR y cELISA. En la Figura 3.2., se expone los resultados obtenidos con las tres técnicas, donde el 28,18% (51/181) de animales fueron positivas por Microscopía de frotis sanguíneo, el 91,71% (166/181) por PCR y el 91,16%(165/181) de bovinos fueron positivas por cELISA (Anexo C). Complementariamente la prevalencia obtenida se distribuyo según la edad, sexo y procedencia de los bovinos. 13 7,18% 13 7,18% 17 9,39% 20 11,05% 27 14,92% 89 49,17% 2 1,10% Cotopaxi Esmeraldas Manabí Orellana Pichincha Sto. D. de los Tsachilas Sucumbios Figura 3.2. Frecuencia de bovinos positivos y negativos a de frotis sanguíneo, PCR y cELISA, expresada en porcentajes 3.2.1 Microscopía de Mediante la tinción G positivas a A. marginale puntiformes en la periferia de los glóbulos rojos a). Figura 3. a.) Muestra No.416 b.) Muestra No. 318 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Microscopía de frotis sanguíneo Po rc en ta je (% ) frotis sanguíneo Positivos Negativos 54 Anaplasma marginale frotis sanguíneo iemsa realizadas en frotis sanguíneo a aquellas muestras sanguíneos que presentaban corpúsculos , como se observa en la b). 3. Microscopía de frotis sanguíneo con tinción Giemsa PCR cELISA 28,18 91,71 91,16 71,82 8,29 8,84 51 166 165 130 15 16 por microscopía se consideró como Figura 3.3. 100X 55 3.2.1.1 Presencia de A. marginale en bovinos muestreados en la EMRQ según edad, sexo y procedencia mediante la técnica de microscopía de frotis sanguíneo 3.2.1.1.1 Edad La presencia de A. marginale en los bovinos positivos a través de la microscopía de frotis sanguíneo, según la edad se expone en la Tabla 3.2., obteniéndose valores de 6,63% (12/33), 10,50% (19/91) y 11,05% (20/57) para los grupos etarios, I (0 -12 meses), II (13 - 36 meses) y III (> 36 meses), respectivamente. Sobre la base de la evidencia muestral recopilada, y utilizando la prueba de hipótesis χ2, se dedujo que la presencia o ausencia de la enfermedad es independiente de la edad del bovino (p = 0,0892). Tabla 3.2. Prevalencia de Anaplasma marginale en bovinos muestreados en la EMRQ según la edad mediante la técnica de microscopía de frotis sanguíneo 3.2.1.1.2 Sexo Con respecto al sexo, la presencia de A. marginale en los bovinos positivos a través de la microscopía de frotis sanguíneo fue de 22, 86% (32/140) en machos y 46,34% (19/41) en hembras (Figura 3.4.). Según la base de la evidencia muestral recopilada, y haciendo uso de la prueba de independencia, χ2, se demostró que la presencia o ausencia de la enfermedad depende del sexo del bovino (p = 0,0033). I 0- 12 33 12 ( 36,36 %) II 13-36 91 19 ( 20,88 %) III > 36 57 20 ( 35,09 %) 181 51 ( 28,18 %) Grupo etario Total Edad (meses) No. Animales Positivo Microscopía de frotis sanguíneo 56 Figura 3.4. Prevalencia de Anaplasma marginale en bovinos muestreados en la EMRQ según el sexo mediante la microscopía de frotis sanguíneo 3.2.1.1.3 Procedencia La procedencia de los bovinos positivos a A. marginale a través de la microscopía de frotis sanguíneo se observa en la Figura 3.5., donde se puede evidenciar que el 7,69% (1/13) de bovinos tuvo origen en la provincia de Cotopaxi, el 30,77% (4/13) de Esmeraldas, el 52,94% (9/17) de Manabí, el 50% (10/20) de Orellana, el 11,11% (3/27) de Pichincha y el 26,97% (24/89) de Sto. Domingo de los Tsachilas. Sobre la base de la evidencia muestral recopilada y aplicando la prueba de independencia χ2, se determinó que la procedencia del bovino influye en la presencia o ausencia de la enfermedad (p = 0,0081). Figura 3.5. Prevalencia de Anaplasma marginale en bovinos muestreados en la EMRQ según la procedencia del mismo mediante microscopía de frotis sanguíneo 32 22,86% 108 77,14% machos positivos machos negativos 19 46,34% 22 53,66% hembras positivos hembras negativos 0,00 10,00 20,00 30,00 40,00 50,00 60,00 70,00 80,00 90,00 100,00 Cotopaxi Esmeraldas Manabí Orellana Pichincha Sto. D. de los Tsachilas Sucumbios 7,69 30,77 52,94 50,00 11,11 26,97 0,0092,31 69,23 47,06 50,00 88,89 73,03 100,00 Po rc en ta je (% ) Tsachilas Positvo 1 4 9 10 3 24 0 Negativo 12 9 8 10 24 65 2 57 3.2.2 PCR 3.2.2.1 Cuantificación de ADN Para determinar la concentración de ADN se realizaron tres diluciones, 1:10; 1:25 y 1:100 del ADN (control positivo), obteniéndose concentraciones de 79,07; 9,84 y 10,51 ng/µL, respectivamente. (Cuadro 3.1.). Cuadro 3.1. Cuantificación por fluorometría del ADN (control positivo) 3.2.2.2 Optimización del sistema de PCR Debido a la presencia de productos inespecíficos, se vio en la necesidad de optimizar las condiciones de la PCR, para ello se modificaron parámetros como la temperatura de hibridación y adición de adyuvantes. 3.2.2.2.1 Ensayo de gradiente de temperatura Para este ensayo se utilizó un volumen de reacción de 50 µL con 2,5 U de Taq Polimerasa y dilución de ADN 1:25. El gradiente de temperatura fue 55, 57, 59, 61, 63 °C. En la Figura 3.6., se observa que con las temperaturas de hibridación 55, 57, 59 °C, hay la presencia de productos inespecíficos, la mejor reacción se observó a 61 °C. 1era lectura 2da lectura 3era lectura dilución1:10 386 392 408 395,33 79,07 dilución 1:25 41,3 53,8 52,5 49,20 9,84 dilución 1:100 48,9 53,1 55,7 52,57 10,51 Concentración de la muestra (ng/µL) ng/mL MUESTRAS 1 2 3 Figura 1. Marcador 100 pb 5-6. T. 57 °C 10. Control negativo 14. T 63°C 3.2.2.2.2 Ensayo de adyuvantes En el ensayo de la U de Taq Polimerasa. Glicerol 5% hubo la presencia de productos inespecíficos, de igual intensidad de los productos inespecíficos obtenidos en la reacción en donde no hubo la adición de adyuvantes (carril 11-12), con en los productos inespecíficos, es decir con este adyuvante se observó la mejor reacción. 1 1. Marcador de 100 pb 4. Control negativo 7. Control negativo 10. Control negativo 100 600 200 2072 1500 bp 100 200 600 1500 2072 pb 58 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 3.6. Ensayo de gradiente de temperatura 2-3. T 55 °C 4. Control negativo 7. Control negativo 8-9. T 59 °C 11-12. T. 61 °C 13. Control negativo 15. Control negativo Figura 3.7., se utilizó un volumen de reacción de Con la adición de BSA 0,8 µg/µL no hubo amplificación, con la adición de sulfato de amonio se observó menos intensidad 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Figura 3.7. Ensayo de adyuvantes 2-3. BSA 0,8 µg/µL 5-6. Glicerol 5% 8-9. Sulfato de amonio 3 mM 11-12. Sin adyuvante Productos inespecíficos 14 15 30 µL con 1,25 59 Los resultados obtenidos sugieren que las condiciones óptimas para la PCR fueron 30 picomol (pmol) de cada primer, 1,5 mM MgCl2, 1X PCR Buffer, 0,4 mM dNTPs, Sulfato de amonio 3 mM y 1,5 U de Taq DNA polimerasa en un volumen final de 30 µL, y para un volumen de reacción de 50 µL fueron 30 pmol de cada primer, 1,5 mM MgCl2, 1X PCR Buffer, 0,4 mM dNTPs y 2,5 U de Taq DNA polimerasa. Las condiciones se ciclaje fueron: desnaturación inicial de 96 °C por cuatro minutos, 96 °C por 30 segundos, 61 °C por 30 segundos, 72°C por 30 segundos, este ciclo se repitió 35 veces. Una vez terminado se hizo una extensión final a 72°C por diez minutos en un termociclador (Cuadro 3.2.). Cuadro 3.2. Condiciones óptimas para la amplificación de Anaplasma marginale. 30 µL 50 µL 3 Mm ____ 2,5 U/µL 1,5 U/µL No. de ciclos Proceso Temperatura (°C) Tiempo 1 Denaturación inicial 96 4 min 35 Denaturación 96 30 s 35 Alineamiento 61 30 s 35 Extensión 72 30 s 1 Extensión final 72 4 min 1 Detener la reacción 4 10 min Volumen de reacción Condiciones de ciclaje Reactivos Primers Am9/Am10 dNTP s´ MgCl2 Buffer 30 pmoles 0,4 mM Sulfato Taq Polimerasa (Invitrogen) Taq Polimerasa (Promega) 1,5 mM 1X 3.2.2.3 Ensayo de sensibilidad analítica Para determinar del ADN (control positivo). En el ensayo Taq Polimerasa como se observa en la cuya concentración es 0,00001051 ng/ hemoparásito; la dilución 1.10 pocillos en la cámara de electroforesis reacción con 1,25 U de Taq cuya concentración es 0.0001051 ng/ hemoparásito. 1 2 3 4 5 Figura 1. Marcador de 100 pb 6-7. dilución 1:104 12-13. dilución 1:107 18-19. dilución 1:1010 Cuadro 3.3. Cuantificación de ADN de las diluciones seriadas de dilución1:101 dilución 1:102 dilución 1:103 dilución 1:104 dilución 1:105 dilución 1:106 dilución 1:107 dilución 1:108 MUESTRAS Concentración de la muestra 100 200 600 1500 pb 60 la sensibilidad analítica se realizó una PCR de 50 µL de volumen de reacción Figura 3.8., se pudo detectar hasta µL= 0.01051 pg/µL de ADN gen 1 , no se muestra en la figura, ya que no había suficientes (Cuadro 3.3.). En el ensayo de 30 µL Polimerasa 5U/µL, el límite de detección fue µL = 0.1051 pg/µL de ADN gen 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 3.8. Sensibilidad analítica por concentración de ADN. 2-3. dilución 1:102 4 8-9. dilución 1:105 10 14-15. dilución 1:108 16 20. Control negativo Anaplasma 79,07 10,51 1,051 0,1051 0,01051 0,001051 0,0001051 0,00001051 (ng/µL) 50 µL = 1:10 30 µL = 1:107 , utilizando diluciones con 2,5 U de la dilución 1:108 ómico de este de volumen de la dilución 1:107 ómico de este 17 18 19 20 -5. dilución 1:103 -11. dilución 1:106 -17. dilución 1:109 marginale. 8 3.2.2.4 Procesamiento de las muestras Controles negativos Se amplificaron 10 muestras de ADN de IASA (ESPE), como se observa en a que no hubo la presencia de la banda de 200 p es decir los bovinos no presentaron la enfermedad 1 2 Figura 3.9. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para el diagnóstico de muestras de ADN de sangre de bovinos 1. Marcador 100 pb DNA 4. Bovino No. 620 7. Bovino No. 721 10. Bovino No. 807 13. Control positivo ADN dilución 1:10000. 50 µL Para la amplificación de las primeras 4 de 50 µL. Como se observa en la Figura 3.1 positivas, ya que se amplificó una band presencia de A. marginale positivas aunque su amplicón fue de menor intensidad comparado con los amplicones de las otras muestras. La muestra Bovino muestra estaba hemolizada. 100 pb 2072 400 1500 600 200 61 bovinos que provinieron de la hacienda del la Figura 3.9., las diez muestras fueron negativas ares de bases que identifica a . 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 muestreados en EMRQ. 2. Bovino No. 216 3 Bovino No. 603 5. Bovino No. 705 6. Bovino No. 719 8. Bovino No. 726 9. Bovino No. 735 11. Bovino No. 827 12. Control negativo 3 muestras se utilizó un volumen de reacción 0., las diez muestras procesadas fueron a única de 200 pares de bases, lo que denota la , las muestras de bovinos No. 76 y 119 se les consideró como No. 101 fue eliminada ya que el suero de esta debido A. marginale A. marginale en 1 Figura 3.10. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para el diagnóstico de muestras de ADN de sangre de bovinos 1. Marcador 100 pb DNA 4. Bovino No. 98 7. Bovino No. 110 10. Bovino No. 130 13. Control negativo En la Figura 3.1 fueron positivas, debido a la presencia de la banda única de 200 pb, lo que denota la presencia de A. marginale eliminadas, ya que no había las muestras de suero para realizar el diagnóstico con la técnica de cELISA. 1 2 3 4 5 Figura 3.11. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para el diagnóstico de muestras de ADN de sangre de bovinos 1. Bovino No. 147 4. Bovino No. 157 7. Bovino No. 181 10. Bovino No. 205 13. Bovino No. 224 16. Bovino No. 272 19. Bovino No. 289 100 200 400 600 1500 2072 pb 62 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 muestreados en EMRQ. 2. Bovino No. 76 3. Bovino No. 93 5. Bovino No. 101 6. Bovino No. 107 8. Bovino No. 119 9. Bovino No. 127 11. Bovino No. 138 12. Control positivo dilución 1:25 1., se observa la amplificación de 19 muestras de las cuales todas . Las muestras de bovinos No. 272 y 287 también fueron 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 muestreados en EMRQ. 2. Bovino No. 151 3. Bovino No. 153 5. Bovino No. 162 6. Bovino No. 169 8. Bovino No. 184 9. Bovino No. 201 11. Bovino No. 213 12. Bovino No. 216 14. Bovino No. 237 15. Bovino No. 248 17. Bovino No. 286 18. Bovino No. 287 20. Marcador 100 pb Muestras positivas A. marginale en 17 18 19 20 A. marginale en 100 200 600 1500 pb 400 En la Figura 3.1 fueron positivas. La muestra de bovino No. 2 del amplicón fue menor comparado con los amplicones de la 1 2 3 4 5 Figura 3.12. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para el diagnós muestras de ADN de sangre de bovinos 1. Bovino No. 290 4. Bovino No. 296 7. Bovino No. 305 10. Bovino No. 311 13. Bovino No. 316 16. Bovino No. 322 19. Control negativo 30 µL Para el procesamiento de las restantes 138 muestras se utilizó un volumen de reacción de 30 µL. En la Figura 3.1 (Bovinos No. 77, 79, 80, 82, 84, 85, 87, 90, 91, 92, 95, 99, 102, 103), las muestras No. 81, 89 y 97 fueron negativas ya que no se amplificó la banda única de 200 pares de bases, lo que denota la presencia de 63 2., se observa la amplificación de 17 muestras de las cuales todas 90 fue considerada positiva aunque el tamaño s demás muestras. 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 tico de muestreados en EMRQ. 2. Bovino No. 292 3. Bovino No. 293 5. Bovino No. 301 6. Bovino No. 303 8. Bovino No. 307 9. Bovino No. 310 11. Bovino No. 313 12. Bovino No. 315 14. Bovino No. 318 15. Bovino No. 320 17. Bovino No. 323 18. Control positivo di 20. Marcador 100 pb 3., de las 17 muestras procesadas, 14 A. marginale. 17 18 19 20 A. marginale en lución 1:25 fueron positivas 100 1500 600 200 pb 1 2 3 4 5 Figura 3.13. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para el diagnóstico de muestras de ADN de sangre de bovinos 1. Marcador 100 pb 4. Bovino No. 80 7. Bovino No. 84 10. Bovino No. 89 13. Bovino No. 92 16. Bovino No. 99 19. Control negativo En la Figura 3.14 104, 112, 113, 114, 115, 117, 118, 122, 123, 124, 125, 126, 128, 129, 131 negativas (Bovino No. 106 y 111) 1 2 3 4 5 Figura 3.14. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para el diagnóstico de muestras de ADN de sangre de bovinos 1. Marcador 100 pb 4. Bovino No. 111 7. Bovino No. 114 10. Bovino No. 118 13. Bovino No. 124 16. Bovino No. 128 19. Control negativo 100 200 600 2072 pb 100 200 600 2072 pb Muestras negativas 64 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 muestreados en EMRQ. 2. Bovino No. 77 3. Bovino No. 79 5. Bovino No. 81 6. Bovino No. 82 8. Bovino No. 85 9. Bovino No. 87 11. Bovino No. 90 12. Bovino No. 91 14. Bovino No. 95 15. Bovino No. 97 17. Bovino No. 102 18. Bovino No. 103 20. Control positivo dilución 1:100 ., de las 17 muestras procesadas, 15 fueron positivas (Bovinos No. 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 muestreados en EM 2. Bovino No. 104 3. Bovino No. 106 5. Bovino No. 112 6. Bovino No. 113 8. Bovino No. 115 9. Bovino No. 117 11. Bovino No. 122 12. Bovino No. 123 14. Bovino No. 125 15. Bovino No. 126 17. Bovino No. 129 18. Bovino No. 131 20. Control positivo dilución 1:100 17 18 19 20 A. marginale en ) y 2 fueron 17 18 19 20 A. marginale en RQ. En la Figura 3.15 158, 161, 168, 172, 174, 182, 187, 188, 189, 191, 197, 198, 199, 203, 204, 207 amplificó la banda única de 200 pares de bases, lo que denota la presencia y la 1 muestra restante (bovino No. 1 1 2 3 4 5 Figura 3.15. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para el diagnóstico de muestras de ADN de sangre de bovinos 1. Marcador 100 pb 4. Bovino No. 168 7. Bovino No. 174 10. Bovino No. 188 13. Bovino No. 197 16. Bovino No. 203 19. Control negativo En la Figura 3.1 fueron positivas. La muestra de bovino del amplicón fue menor comparado con los amplicones de las demás muestras. 100 2072 600 200 pb 65 ., de las 17 muestras procesadas, 16 fueron p 73) fue negativa. 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 muestreados en EMRQ. 2. Bovino No. 158 3. Bovino No. 161 5. Bovino No. 172 6. Bovino No. 173 8. Bovino No. 182 9. Bovino No. 187 11. Bovino No. 189 12. Bovino No. 191 14. Bovino No. 198 15. Bovino No. 199 17. Bovino No. 204 18. Bovino No. 207 20. Control positivo dilución 1:100 6, se observó la amplificación de 17 muestras de las cuales todas No. 218 fue considerada positiva aunque el tamaño ositivas (Bovinos No. ), ya que se de A. marginale, 17 18 19 20 A. marginale en 1 2 3 4 5 Figura 3.16. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para el diagnóstico de muestras de ADN de sangre de bovinos 1. Marcador 100 pb 4. Bovino No. 209 7. Bovino No. 212 10. Bovino No. 218 13. Bovino No. 222 16. Bovino No. 228 19. Control negativo En la Figura 3.1 fueron positivas. Las muestra aunque el tamaño del amplicón fue menor comparado con los amplicones de las demás muestras. 1 2 3 4 5 Figura 3.17. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para el diagnóstico de muestras de ADN de sangre de bovinos 1. Marcador 100 pb 4. Bovino No. 276 7. Bovino No. 291 10. Bovino No. 298 13. Bovino No. 307 16. Bovino No. 321 19. Control negativo 100 200 600 2072 pb 100 200 600 2072 pb 66 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 muestreados en EMRQ. 2. Bovino No. 195 3. Bovino No 5. Bovino No. 210 6. Bovino No. 211 8. Bovino No. 214 9. Bovino No. 215 11. Bovino No. 219 12. Bovino No. 220 14. Bovino No. 223 15. Bovino No. 226 17. Bovino No. 229 18. Bovino No. 230 20. Control positivo dilución 1:100 7., se observa la amplificación de 17 muestras de la s de bovinos No. 295 y 299 fueron consideradas positivas 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 muestreados en EMR 2. Bovino No. 274 3. Bovino No. 275 5. Bovino No. 281 6. Bovino No. 282 8. Bovino No. 295 9. Bovino No. 297 11. Bovino No. 299 12. Bovino No. 300 14. Bovino No. 314 15. Bovino No. 319 17. Bovino No. 224 18. Bovino No. 326 20. Control positivo dilución 1:100 Amplicones de baja intensidad muestras positivas 17 18 19 20 A. marginale en . 206 s cuales todas 17 18 19 20 A. marginale en Q. En la Figura 3.18., de las 17 muestras procesadas, 1 restantes (bovinos No. 342 y 346 1 2 3 4 5 Figura 3.18. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para el diagnóstico de muestras de ADN de sangre de bovinos 1. Marcador 100 pb 4. Bovino No. 332 7. Bovino No. 337 10. Bovino No. 341 13. Bovino No. 347 16. Bovino No. 351 19. Control negativo En la Figura 3.19 fueron positivas, debido a la presencia de la banda única de 200 pb, lo que denot presencia de A. marginale positivas aunque el tamaño del amplicón fue demás muestras. 1 2 Figura 3.19. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para el di muestras de ADN de sangre de bovinos 1. Marcador 100 pb 4. Bovino No. 359 7. Bovino No. 364 10. Control negativo 200 1500 600 400 100 pb 2072 100 200 400 600 2072 pb 67 5 fueron positivas ) fueron negativas. 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 muestreados en EMRQ. 2. Bovino No. 327 3. Bovino No. 330 5. Bovino No. 333 6. Bovino No. 334 8. Bovino No. 338 9. Bovino No. 339 11. Bovino No. 342 12. Bovino No. 346 14. Bovino No. 348 15. Bovino No. 349 17. Bovino No. 352 18. Bovino No. 356 20. Control positivo dilución 1:100 ., se observa la amplificación de 8 muestras de las cuales todas . Las muestras de bovinos No. 358 y 362 fueron consideradas menor comparado con los amplicones de las 3 4 5 6 7 8 9 10 agnóstico de muestreados en EMRQ. 2. Bovino No. 357 3. Bovino No. 358 5. Bovino No. 360 6. Bovino No. 362 8. Bovino No. 365 9. Bovino No. 416 11. Control + dilución 1:1000 muestras negativas Amplicones de baja intensidad muestras positivas y las 2 muestras 17 18 19 20 A. marginale en a la 11 A. marginale en 68 3.2.2.5 Presencia de A. marginale en bovinos muestreados en la EMRQ según sexo, edad y procedencia mediante la técnica de PCR 3.2.2.5.1 Edad Con respecto a la edad, la presencia de A. marginale en los bovinos positivos a través de PCR se expone en la Tabla 3.3., donde el 87,88% (29/33) de bovinos se encuentran dentro del Grupo I, el 91,21% (83/91) en el Grupo II y el 94,74% (54/57) en el grupo III. De acuerdo a la evidencia muestral recopilada y utilizando la prueba de hipótesis χ 2 , se dedujo que la presencia o ausencia de la enfermedad es independiente de la edad del bovino (p = 0, 5080). Tabla 3.3. Prevalencia de Anaplasma marginale en bovinos muestreados en la EMRQ según la edad mediante la técnica de PCR 3.2.2.5.2 Sexo La presencia de A. marginale en los bovinos positivos mediante PCR, según el sexo se observa en la Figura 3.20., donde se puede evidenciar que el 95,12% (39/40) de bovinos fueron hembras y el 90,71% (127/140) machos. Sobre la base de la evidencia muestral recopilada, y haciendo uso de la prueba de hipótesis, χ2, se demostró que la presencia o ausencia de la enfermedad es independiente del sexo del bovino (p = 0, 3679). I 0- 12 33 29 ( 87,88 %) II 13-36 91 83 ( 91,21 %) III > 36 57 54 ( 94,74 %) 181 166 ( 91,71 %) Grupo etario Edad(meses) No. Animales PCR Positivo Total 69 Figura 3.20. Prevalencia de Anaplasma marginale en bovinos muestreados en la EMRQ según el sexo mediante la técnica de PCR 3.2.2.5.3 Procedencia La presencia de A. marginale en los bovinos positivos mediante PCR según la procedencia se observa Figura 3.21., donde el 84,62% (11/13) de bovinos procedieron de la provincia de Cotopaxi, el 100% (13/13) de Esmeraldas, el 100% (17/17) de Manabí, el 95% (19/20) de Orellana, el 77,78% (21/27) de Pichincha, el 93,26%(83/89) de Sto. Domingo de los Tsachilas y el 100% (2/2) de bovinos procedieron de la provincia de Sucumbios. Sobre la base de la evidencia muestral recopilada y utilizando la prueba de hipótesis χ2, se determinó que la presencia o ausencia de la enfermedad es independiente del lugar de donde proviene el bovino (p = 0,0819). Figura 3.21. Prevalencia de Anaplasma marginale en bovinos muestreados en la EMRQ según la procedencia mediante la técnica de PCR 127 90,71% 13 9,29% machos positivos machos negativos 39 95,12% 2 4,88% hembras positivos hembras negativos 0,00 10,00 20,00 30,00 40,00 50,00 60,00 70,00 80,00 90,00 100,00 Cotopaxi Esmeraldas Manabí Orellana Pichincha Sto. D. de los Tsachilas Sucumbios 84,62 100,00 100,00 95,00 77,78 93,26 100,00 15,38 0,00 0,00 5,00 22,22 6,74 0,00 Po rc en ta je (% ) Tsachilas Positvo 11 13 17 19 21 83 2 Negativo 2 0 0 1 6 6 0 70 3.2.3 cELISA 3.2.3.1 Cálculo de parámetros de validación para el diagnóstico de A. marginale en muestras de suero de bovinos muestreados en la EMRQ En la Tabla 3.4., se detalla las densidades ópticas obtenidas del control positivo añadido por duplicado y control negativo añadido por triplicado, en cada placa de cELISA. Los cálculos de la media (@) para el control negativo fue de 1,516 y 1,414 para las placas No.1 y placas No. 2, respectivamente. El porcentaje de inhibición (%I) para el control positivo fue de 52,034 y 38,377 para la para la placa No.1 y 50,483 y 49,705% para la placa No. 2. Tabla 3.4. Densidad óptica (D.O.) del control positivo y control negativo para la prueba cELISA. Estos parámetros calculados, se encontraron en los rangos establecidos por el kit de diagnostico, (@ O.D. control negativo debe estar entre 0.40 y 2.10, y el %I del control positivo debe estar ≥ 30%). 3.2.3.2 Umbral de positividad e interpretación de los resultados El umbral de positividad proporcionado por el kit es de ≥30% de inhibición. En la Tabla 3.5., se observa la D.O., el %I y la interpretación como positiva o negativa de cada muestra. D.O. % de Inhibición D.O. 1 0,727 52,034 1,315 2 0,934 38,377 1,482 3 1,750 1 0,700 50,483 1,282 2 0,711 49,705 1,287 3 1,672 2 1 Número de repeticiones No. Placas 1,414 Control positivo Control negativo 1,516 71 Tabla 3.5. Resultados obtenidos con la técnica de cELISA en las muestras de suero de los bovinos muestreados en la Empresa metropolitana de rastro de Quito (EMRQ). No. N o . m u es tr a D.O. % I cELISA No. No . m u es tr a D.O. % I cELISA No. No . m u es tr a D.O. % I cELISA 1 76 0,504 66,747 positivo 62 157 0,436 71,234 positivo 122 265 0,605 60,084 positivo 2 77 0,770 45,532 positivo 63 158 0,627 55,647 positivo 123 274 0,474 66,470 positivo 3 79 0,757 46,451 positivo 64 161 0,516 63,499 positivo 124 275 0,622 56,001 positivo 4 80 0,558 63,185 positivo 65 162 0,833 45,041 positivo 125 276 0,704 53,552 positivo 5 81 1,070 24,310 negativo 66 168 0,727 48,573 positivo 126 281 0,766 49,461 positivo 6 84 0,856 39,448 positivo 67 169 1,066 29,668 negativo 127 282 0,520 63,216 positivo 7 85 0,498 67,143 positivo 68 172 0,655 53,667 positivo 128 286 0,393 74,071 positivo 8 87 0,483 68,133 positivo 69 173 0,647 57,313 positivo 129 289 0,425 71,960 positivo 9 89 1,164 17,661 negativo 70 174 0,460 67,461 positivo 130 290 0,910 39,960 positivo 10 90 0,366 75,852 positivo 71 181 0,632 58,302 positivo 131 291 0,954 37,057 positivo 11 91 1,004 28,979 negativo 72 182 0,567 59,892 positivo 132 292 0,485 68,001 positivo 12 92 0,613 56,638 positivo 73 184 0,621 59,028 positivo 133 293 0,832 45,107 positivo 13 93 0,415 72,619 positivo 74 187 0,506 64,207 positivo 134 295 0,353 75,029 positivo 14 95 0,821 41,924 positivo 75 188 0,489 65,409 positivo 135 296 0,738 51,309 positivo 15 97 1,011 28,484 negativo 76 189 0,812 46,426 positivo 136 297 0,738 47,795 positivo 16 98 0,970 36,002 positivo 77 191 0,675 52,252 positivo 137 298 0,857 39,378 positivo 17 99 0,431 69,512 positivo 78 195 0,553 60,882 positivo 138 299 0,469 69,057 positivo 18 102 0,383 74,731 positivo 79 197 0,536 62,084 positivo 139 300 0,503 64,419 positivo 19 103 0,510 63,924 positivo 80 198 0,625 58,764 positivo 140 301 0,457 69,848 positivo 20 104 0,835 44,909 positivo 81 201 0,448 70,442 positivo 141 303 0,487 67,869 positivo 21 106 1,295 8,394 negativo 82 203 0,644 54,445 positivo 142 305 0,647 57,313 positivo 22 107 0,733 51,638 positivo 83 204 0,431 69,512 positivo 143 307 1,069 29,470 negativo 23 110 0,394 74,005 positivo 84 205 0,891 41,214 positivo 144 310 0,612 59,622 positivo 24 111 0,613 56,638 positivo 85 206 0,439 68,946 positivo 145 311 0,456 69,914 positivo 25 112 1,015 33,033 positivo 86 207 0,810 42,702 positivo 146 313 0,935 38,311 positivo 26 113 0,732 48,220 positivo 87 209 0,682 55,003 positivo 147 314 0,575 59,326 positivo 27 114 0,492 65,197 positivo 88 210 0,679 51,969 positivo 148 315 0,726 52,100 positivo 28 115 0,459 67,531 positivo 89 211 0,678 52,040 positivo 149 316 0,451 70,244 positivo 29 117 0,576 61,997 positivo 90 212 0,451 68,097 positivo 150 318 0,496 67,275 positivo 30 118 0,515 63,570 positivo 91 213 0,641 57,708 positivo 151 319 0,463 67,248 positivo 31 119 0,422 72,157 positivo 92 214 0,515 63,570 positivo 152 320 0,537 64,570 positivo 32 122 0,768 49,329 positivo 93 215 0,848 40,014 positivo 153 321 0,694 50,908 positivo 33 123 0,628 55,577 positivo 94 216 0,693 54,278 positivo 154 322 1,037 31,581 positivo 34 124 0,428 71,762 positivo 95 218 0,767 45,744 positivo 155 323 0,941 37,915 positivo 35 125 0,703 50,271 positivo 96 220 0,764 49,593 positivo 156 324 0,453 67,956 positivo 36 126 0,506 64,207 positivo 97 222 0,472 66,612 positivo 157 326 0,934 38,377 positivo 37 127 0,580 61,733 positivo 98 223 0,548 61,236 positivo 158 327 1,012 33,231 positivo 38 128 0,528 62,650 positivo 99 224 0,562 62,921 positivo 159 330 0,837 44,777 positivo 39 129 0,725 48,715 positivo 100 226 0,831 41,217 positivo 160 332 0,407 71,210 positivo 40 130 0,665 56,125 positivo 101 228 0,395 73,939 positivo 161 333 0,538 64,504 positivo 41 131 0,517 63,428 positivo 102 229 0,832 41,146 positivo 162 334 0,535 62,155 positivo 42 132 0,546 61,377 positivo 103 230 0,805 43,056 positivo 163 337 0,667 55,993 positivo 43 134 0,460 69,650 positivo 104 231 1,206 20,431 negativo 164 338 0,597 57,769 positivo 44 136 0,439 71,036 positivo 105 233 0,679 55,201 positivo 165 339 0,635 58,104 positivo 45 138 0,530 65,032 positivo 106 234 1,317 13,108 negativo 166 341 0,991 34,616 positivo 46 139 0,983 30,465 positivo 107 235 0,562 60,245 positivo 167 342 0,457 67,673 positivo 47 140 0,732 48,220 positivo 108 237 0,795 47,548 positivo 168 346 1,328 12,382 negativo 48 141 1,061 29,998 negativo 109 238 0,774 48,933 positivo 169 347 0,430 69,583 positivo 49 142 0,512 63,782 positivo 110 240 0,507 66,549 positivo 170 348 0,385 72,766 positivo 50 143 1,291 8,677 negativo 111 243 0,427 69,795 positivo 171 349 0,583 61,535 positivo 51 144 0,661 53,242 positivo 112 244 0,455 67,814 positivo 172 351 0,574 59,396 positivo 52 145 0,633 58,236 positivo 113 245 0,640 54,728 positivo 173 352 0,569 62,459 positivo 53 146 1,021 27,776 negativo 114 248 0,426 71,894 positivo 174 355 0,699 53,882 positivo 54 147 0,568 62,525 positivo 115 250 0,621 59,028 positivo 175 357 0,510 66,351 positivo 55 148 0,458 67,602 positivo 116 255 0,581 58,901 positivo 176 358 0,429 69,653 positivo 56 151 0,719 52,562 positivo 117 256 1,433 -1,368 negativo 177 360 0,418 70,432 positivo 57 152 0,515 63,570 positivo 118 257 0,744 50,913 positivo 178 362 0,658 53,454 positivo 58 153 0,538 64,504 positivo 119 258 0,665 52,959 positivo 179 364 0,682 55,003 positivo 59 154 0,477 66,258 positivo 120 259 0,664 56,191 positivo 180 365 0,554 60,811 positivo 60 155 0,785 44,471 positivo 121 261 1,563 -3,123 negativo 181 416 0,794 47,614 positivo 61 156 0,999 29,333 negativo 72 3.2.3.3 Presencia de A. marginale en bovinos muestreados en la EMRQ según sexo, edad y procedencia mediante la técnica de cELISA 3.2.3.3.1 Edad La presencia de A. marginale en los bovinos positivos a través de cELISA según la edad, se detalla en la Tabla 3.6, donde el 90,91% (30/33) de bovinos se encontraron dentro del grupo de edad de animales de 0 a 12 meses, el 92,31%(84/91) al grupo de edad de 13- 36 meses y el 89,47% (51/57) al grupo de edad de mayores de 36 meses. Sobre la base de la evidencia muestral recopilada, y utilizando la prueba de hipótesis χ2, se dedujo que la presencia o ausencia de la enfermedad es independiente de la edad del bovino (p = 0,8384). Tabla 3.6. Prevalencia de Anaplasma marginale en bovinos muestreados en la EMRQ según la edad mediante la técnica de cELISA 3.2.3.3.2 Sexo De los bovinos positivos a A. marginale a través de cELISA, el 91,43%(128/140) fueron machos y el 90,24% (37/41) fueron hembras (Figura 3.22.). De acuerdo a la evidencia muestral recopilada, y utilizando la prueba de hipótesis χ2, se determinó que la edad del bovino no está asociada con la presencia o ausencia de la enfermedad (p = 0,8142). I 0- 12 33 30 ( 90,91 %) II 13-36 91 84 ( 92,31 %) III > 36 57 51 ( 89,47 %) 181 165 ( 91,16 %) Grupo etario Edad(meses) No. Animales cELISA Positivo Total 73 Figura 3.22. Prevalencia de Anaplasma marginale en bovinos muestreados en la EMRQ según el sexo en bovinos positivos mediante la técnica de cELISA. 3.2.3.3.3 Procedencia En la Figura 3.23 se observa la procedencia de los bovinos positivos a A. marginale, por cELISA, donde se puede evidenciar que el 84,62% (11/13) de bovinos provinieron de la provincia de Cotopaxi, el 100% (13/13) de Esmeraldas, el 100% (17/17) de Manabí, el 85% (17/20) de Orellana, el 81,48% (22/27) de Pichincha, el 93,26% (83/89) de Sto. Domingo de los Tsachilas y el 100% (2/2) de Sucumbios. Sobre la base de la evidencia muestral recopilada y utilizando la prueba de hipótesis χ2, se determinó que la presencia o ausencia de la enfermedad es independiente del lugar de procedencia del bovino (p = 0,3019). Figura 3.23. Prevalencia de Anaplasma marginale en bovinos muestreados en la EMRQ según la procedencia mediante la técnica de cELISA. 128 91,43% 12 8,57% machos positivos machos negativos 37 90,24% 4 9,76% hembras positivos hembras negativos 0,00 10,00 20,00 30,00 40,00 50,00 60,00 70,00 80,00 90,00 100,00 Cotopaxi Esmeraldas Manabí Orellana Pichincha Sto. D. de los Tsachilas Sucumbios 84,62 100,00 100,00 85,00 81,48 93,26 100,00 15,38 0,00 0,00 5,00 22,22 6,74 0,00 Po rc en ta je (% ) Tsachilas Positvo 11 13 17 17 22 83 2 Negativo 2 0 0 3 5 6 0 74 3.3 Comparación de las 3 técnicas de diagnóstico: microscopía de frotis sanguíneo, PCR y cELISA para la detección de A. marginale en los bovinos muestreados en la EMRQ En el Tabla 3.7., se expone los resultados de las 3 técnicas: microscopía de frotis sanguíneo, PCR y cELISA, observándose que de las 181 muestras, 46 (25,41%) fueron positivas por las tres técnicas y 114 (62,98%) fueron positivas por dos técnicas, PCR y cELISA. Tabla 3.7. Comparación entre las tres pruebas diagnósticas para determinar la Prevalencia de Anaplasma marginale en bovinos faenados en la EMRQ. 3.3.1 Determinación de criterios de fiabilidad: Con el fin de evaluar los criterios de fiabilidad, tales como sensibilidad, especificidad y valores predictivos de las técnicas, se realizaron tablas de doble entrada, donde se compararon la microscopía de frotis sanguíneo y cELISA con respecto a la PCR. La PCR fue considerada como la técnica gold standard. Además se evaluó el porcentaje de concordancia, índice de kappa y coeficiente phi entre las técnicas. Microscopía de frotis sanguíneo PCR cELISA Total (muestras analizadas) Porcentaje (%) _ _ _ 9 4,97 _ _ + 3 1,66 _ + _ 4 2,21 _ + + 114 62,98 + _ _ 1 0,55 + _ + 2 1,10 + + _ 2 1,10 + + + 46 25,41 181 100,00Total 75 3.3.1.1 Validación de microscopía de frotis sanguíneo con respecto a PCR Al comparar los resultados de la prueba diagnóstica PCR con los resultados obtenidos por microscopía de frotis sanguíneo, se pudo evidenciar que 48 (26,52%) bovinos fueron positivos a A. marginale por ambas técnicas y 12 (6,63%) fueron negativos. De acuerdo a estos resultados se realizó una tabla de contingencia de doble entrada (Tabla 3.8.) para determinar la sensibilidad, especificidad y valores predictivos de la técnica de microscopía de frotis sanguíneo con respecto a la técnica de PCR, obteniéndose una sensibilidad de 28,92%, especificidad de 80 %, valor predictivo positivo de 94,12% y valor predictivo negativo del 9,23% para la identificación de A. marginale. La prevalencia aparente obtenida para la técnica de microscopía de frotis sanguíneo fue de 28,18%. Además el porcentaje de concordancia observado entre las dos técnicas fue de 33,15%, los valores de kappa y phi, 0,020 y 0,055, respectivamente, indican que no se observó concordancia ni asociación entre la microscopía de frotis sanguíneo y PCR. 76 Tabla 3.8. Concordancia entre las técnicas de PCR y microscopía de frotis sanguíneo para el diagnóstico de Anaplasma marginale en bovinos muestreados en la Empresa metropolitana de Rastro de Quito (EMRQ). 3.3.1.2 Validación de cELISA con respecto a PCR En la Tabla 3.9., se observa que al comparar la técnica de cELISA con respecto a la PCR, 160 (88,40%) bovinos fueron positivos a A. marginale por ambas técnicas y 10 (5,52%) fueron negativos. Para la técnica de cELISA se determinó una sensibilidad de 96,39%, una especificidad de 66,67%, valor predictivo positivo de 96,97% y valor predictivo negativo del 62,50%, para la detección de anticuerpos IgG en los bovinos Positivo 48 ( 26,52 %) 3 ( 1,66 %) 51 Negativo 118 ( 65,19 %) 12 ( 6,63 %) 130 166 15 181 PCRa Total Microscopía de frotis sanguíneob Total NegativoPositivo f. Valor predictivo negativo: (12/130)*100 = 9,23% g. Porcentaje de concordancia: [(48 + 12)/181]*100 = 33,15% h. Indice kappa : 0,020 i. Coeficiente phi: 0,055 Validación de Microscopía de frotis sanguíneo referente a PCR c,d,e,f,g,h,i a. Prevalencia aparente: (166/181)*100 = 91,71% b. Prevalencia aparente: (51/181)*100 = 28,18% c. Sensibilidad: (48/166)*100 = 28,92% d. Especificidad: (12/15)*100 = 80,00% e. Valor predictivo positivo: (48/51)*100 = 94,12% 77 muestreados. El porcentaje de concordancia observado entre las dos técnicas fue de 93,92%. Al realizar los ajustes de concordancia por chance, se pudo evidenciar un alto grado de concordancia entre la PCR y cELISA (índice kappa = 0,612) y una alta asociación entre ambas técnicas (coeficiente phi = 0,612). Las prevalencias aparentes obtenidas con las técnicas de PCR y cELISA fueron de 91,71% y 91,16%, respectivamente. Tabla 3.9. Concordancia entre las técnicas de PCR y cELISA para el diagnóstico de Anaplasma marginale en bovinos muestreados en la Empresa metropolitana de Rastro de Quito (EMRQ). Positivo 160 ( 88,40 %) 5 ( 2,76 %) 165 Negativo 6 ( 3,31 %) 10 ( 5,52 %) 16 166 15 181 NegativoPositivo PCRa Total cELISAb Total Validación de cELISA referente a PCR c,d,e,f,g,h,i b. Prevalencia aparente: (165/181)*100 = 91,16% c. Sensibilidad: (160/166)*100 = 96,39% d. Especificidad: (10/15)*100 = 66,67% e. Valor predictivo positivo: (160/165)*100 = 96,97% f. Valor predictivo negativo: (10/165)*100 = 62,50% g. Porcentaje de concordancia: [(160 + 10)/181]*100 = 93,92% h. Indice kappa : 0,612 i. Coeficiente phi: 0,612 a. Prevalencia aparente: (166/181)*100 = 91,71% 78 3.4 Comparación de 4 técnicas de diagnóstico: microscopía de frotis sanguíneo, PCR, cELISA y iELISA para la detección de A. marginale en los bovinos muestreados en la EMRQ Un total de 34 muestras fueron enviadas al Centro de estudios Biomédicos y veterinarios de la Universidad Nacional Experimental Simón Rodríguez-IDECYT, Venezuela, para su diagnóstico, el cual se realizó con un ELISA indirecto (iELISA). En el Tabla 3.10., se expone los resultados de las 4 técnicas: Microscopía de frotis sanguíneo, PCR, cELISA y ELISA (Venezuela), observándose que de las 34 muestras, 11 (32,35%) fueron positivas por las cuatro técnicas. Analizando las dos técnicas de ELISA, se obtuvo un porcentaje de concordancia, valores de kappa y phi de 67,65%; 0,105 y 0,236, respectivamente, indicando que una baja asociación entre el cELISA y iELISA y una baja relación entre las dos técnicas (cálculos no mostrados). Tabla 3.10. Comparación entre las cuatro pruebas diagnósticas para determinar la Prevalencia de Anaplasma marginale en bovinos muestreados en la EMRQ. 3.5 Recopilación de bibliografía 3.5.1 Epidemiología de anaplasmosis en el Ecuador En el Ecuador desde el año de 1968, se han realizado investigaciones en bovinos con el propósito de demostrar la prevalencia de anaplasmosis. A continuación en la Tabla 3.11., se resumen los resultados de los trabajos realizados en el Ecuador. Microscopía de frotis sanguíneo PCR cELISA ELISA (Venezuela) Total (muestras analizadas) Porcentaje + + + + 11 32,35 + + + - 3 8,82 + + - - 1 2,94 - + + + 11 32,35 - + + - 8 23,53 Total 34 100,00 79 Con respecto al método para el diagnóstico de la enfermedad se han usado la microscopía de frotis sanguíneo con diferentes colorantes, Giemsa, Wright y naranja de acridina, siendo la microscopía de frotis sanguíneo con tinción Giemsa la más utilizada. La primera prueba serológica utilizadas en el país ha sido la prueba de aglutinación capilar. Las prevalencias determinadas en las provincias de Guayas, Manabí y Sto. Domingo de los Tsachilas fueron realizadas con microscopía de frotis sanguíneo con tinción Giemsa. Para Guayas, se han obteniendo porcentajes de 50,05; 40; 17,5; 9, para Manabí, prevalencias de 29,5% y 65,2% en los cantones de Paján y Chone, respectivamente y 6,67% y 28,6% para Sto. Domingo de los Tsachilas. La microscopía de fluorescencia con tinción de naranja de acridina, han sido utilizada, obteniendo una prevalencia de 8,89% para la provincias de Sto. Domingo de los Tsachilas (Martínez, 1975). La prevalencia de Manabí (43%) ha sido determinada con microscopía con tinción Wright (Benítez, 2003). La prueba de aglutinación capilar, ha sido usada en las provincias de Pichincha, Sto. Domingo de los Tsachilas y Guayas, obteniendo prevalencias de 27,50%, 62,85% y 100%, respectivamente (Balda, 1968 & Pérez, 1998). 80 Tabla 3.11. Estudio de la prevalencia de anaplasmosis determinada en Ecuador Autor Método de diagnóstico Provincia Cantón No. Bovinos muestreados Prevalencia (%) Sto. Domingo de los Tsachilas ____ 70 62,85 Pichincha ___ 80 27,50 Fluorescencia (colorante naranja de acridina) 8,89 Frotis sanguíneo (colorante de Giemsa) 6,67 Luque, (1961, citado por Villafuerte G., 2001) Frotis sanguíneo (colorante de Giemsa) Guayas ____ ____ 50,05 Rosillo, (1996, citado por Villafuerte G., 2001) Frotis sanguíneo (colorante de Giemsa) Sto. Domingo de los Tsachilas ____ ____ 28,60 Herrera, (1997, citado por Villafuerte G., 2001) Frotis sanguíneo (colorante de Giemsa) Guayas Naranjal ____ 40 Perez, (1998, citado por Villafuerte G., 2001) Aglutinación capilar Guayas Guayaquil ____ 100 Cueva, (2000, citado por Villafuerte G., 2001) Frotis sanguíneo (colorante de Giemsa) Manabí Paján ____ 29,50 Villafuerte, (2001) Frotis sanguíneo (colorante de Giemsa) Guayas Lomas de Sargentillo 200 17,50 Benítez, (2003) Frotis sanguíneo (colorante de Wright) Manabí Jama 300 43 Arreaga; (2004) Frotis sanguíneo (colorante de Giemsa) Guayas General Antonio Elizalde (Bucay) 300 9 Villamir, (2005) Frotis sanguíneo (colorante de Giemsa) Manabí Chone 410 65,20 Martínez, (1975) Balda, (1968) Aglutinación capilar (ANATEST) 135 Sto. Domingo de los Tsachilas ___ 81 CAPÍTULO 4: DISCUSIÓN Para determinar la presencia de A. marginale se visitó la EMRQ en donde se muestrearon 181 bovinos, de los cuales se recopiló información como: edad, sexo y procedencia. Para realizar el diagnóstico se utilizaron tres técnicas: microscopía de frotis sanguíneo, PCR y cELISA. Se determino la prevalencia aparente con cada técnica, y se obtuvo la prevalencia según la edad, sexo y procedencia de los bovinos. 4.1 Microscopía de frotis sanguíneo En los frotis, A. marginale aparece dentro de los glóbulos rojos como cuerpos densos y redondeados de 0.3-1.0 µm de diámetro, la mayor parte de ellos situados en la zona marginal del glóbulo rojo o en su proximidad (OIE, 2004). Mediante la tinción Giemsa realizadas en frotis sanguíneo se consideró como positivas a A. marginale a aquellas muestras que presentaban corpúsculos puntiformes en la periferia de los glóbulos rojos teñidos de azul púrpura. En el trabajo realizado por Benítez (2003), se reporta que A. marginale adquiere una tonalidad azul y algo levemente rojiza con este colorante y morfológicamente se observan de formas esféricas, ubicados en el margen de los eritrocitos. Durante la intervención en la Empresa Metropolitana de Quito (EMRQ) se pudo determinar que de 181 animales el 28,18% (51/181) fueron positivos a A. marginale por la técnica de microscopía de frotis sanguíneo. Según los trabajos realizados en el país relacionados con la determinación de la prevalencia de anaplasmosis en hatos ganaderos mediante está técnica se evidencio que las cifras reportadas van desde 6,67% al 65,20% (Tabla 3.12.). Estos datos están en concordancia con lo encontrado en estudios realizados en Argentina en donde se demostraron prevalencias reportadas con está técnica, en diferentes zonas, que van desde un 7% hasta 61% (Kocan et al., 2003). 82 En cuanto a la edad de los bovinos, las diferencias observadas no tuvieron una significancia estadística (p>0,05), lo que demuestra que la edad no influyó en la presencia o ausencia de la enfermedad. Para Benítez (2003) y Arreaga (2004) todos los animales están predispuestos a la infección sin importar la edad, sin embargo en el trabajo realizado por Villafuerte (2001), la susceptibilidad de los bovinos a Anaplasma tiende a estar asociado con la edad, determinando que a mayor edad, los animales son más propensos. Con relación al sexo, si se observaron diferencias significativas (p<0,05) indicando que la presencia o ausencia de la enfermedad depende del sexo del bovino. En el Ecuador, tradicionalmente los animales machos son destinados a la producción de carne por lo que son llevados en mayor proporción al faenamiento. Según Arreaga (2004) en un estudio realizado en haciendas de la Provincia del Guayas en animales de doble propósito determinó una prevalencia de 1,3% en machos y 7,7% en hembras, por otra parte Villamil (2005) reportó prevalencias en machos y hembras de 62% y 65,9% respectivamente, indicando que no existen diferencias estadísticas. Con respecto a la procedencia, los bovinos que ingresan a la EMRQ presentan una guía de movilización que es obligatoria para el faenamiento, en donde consta la procedencia de los animales. Los bovinos muestreados procedieron de 7 provincias del Ecuador, observándose que el 49,17% (89/181) de bovinos procedieron de la provincia de Sto. Domingo de los Tsachilas. Esto se debe a que esta zona es considerada como una de las más importantes en la producción bovina y debido a su proximidad a la capital, abastece de ganado destinado para el consumo de carne, además en esta provincia se realizan ferias de comercialización de ganado todas las semanas. Sobre la base estadística, se encontraron diferencias significativas (p< 0,005), determinándose que la procedencia del bovino influye en la presencia o ausencia de la enfermedad. La prevalencia obtenida en la provincia de Sto. Domingo de los Tsachilas con esta técnica fue de 26,97% (24/89), inferior a la reportada en el trabajo realizado por Martínez (1975) y superior a la obtenida por Rosillo 83 (1996), quienes utilizando está técnica como medio de diagnóstico, obtuvieron valores de 6,67% y 28,6%, respectivamente (Tabla 3.12.). Al comparar los resultados obtenidos de PCR con los de microscopía de frotis sanguíneo, se obtuvo 48 bovinos diagnosticados como positivos a A. marginale por ambas técnicas. Los animales que fueron positivos por microscopía de frotis sanguíneos se encontraban, al parecer, en un pico de la rickettsemia, que hace que los niveles de la bacteria aumenten y puedan ser visualizados al microscopio, teniendo en cuenta la baja sensibilidad de la técnica (Melman et al., 2004).). Los 121 bovinos restantes difieren en su diagnóstico, pues 118 de las muestras resultaron positivas por PCR y negativas a la microscopía de frotis sanguíneo, y las 3 muestras restantes fueron negativas por PCR y positivas por microscopía de frotis sanguíneo. El primer caso, podría deberse a que estos bovinos presentaron porcentajes muy bajos de glóbulos rojos infectados para poder ser detectados por la microscopía de frotis sanguíneo. En el segundo caso, en el que las muestras negativas por PCR fueron positivas a microscopía de frotis sanguíneo, pudiera deberse a falsos positivos, donde A. marginale fue confundido por otras estructuras o por residuos de colorante. Estos resultados son comparables con los reportados por Noaman et al. (2009), en donde observaron estructuras en los eritrocitos de 17 muestras de sangre que resultaron negativas por PCR, ellos determinaron que podría ser cuerpos de Heinz, cuerpos de Howell-Jolly o residuos de tinción. Se ha demostrado que el colorante de Giemsa puede originar falsos positivos debido a ciertos depósitos de precipitados sobre la células rojas similares a la rickettsia, o falsos negativos, que resultan cuando el porcentaje de glóbulos rojos infectados es muy bajo. Por este motivo Caballero (1993) ha reportado un método más sensible, simple y relativamente económico para la detección de A. marginale por microscopía de fluorescencia utilizando naranja de acridina-bromuro de etidio. 84 En cuanto a los criterios de fiabilidad, la técnica de microscopía de frotis sanguíneo presentó sensibilidad de 28,92%, especificidad de 80%, valor predictivo positivo de 94,12% y valor predictivo negativo de 9,23%, es decir, utilizando esta técnica se clasificaron correctamente como enfermos al 28,92% de los que padecieron anaplasmosis y como sanos al 80% de los que no se encontraban enfermos de anaplasmosis. En cuanto a los valores predictivos, ellos significan que en un 94,12% de los bovinos con anaplasmosis finalmente se confirmó la presencia A. marginale, mientras que de los que no se detectaron la presencia de la enfermedad un 9,23% estaban efectivamente sanos. Estos resultados difieren con los resultados reportados por Figueroa et al. (1996), donde reporta valores de sensibilidad y especificidad de 93,8 y 100%, respectivamente y valores predictivos positivo y negativo de 100% y 97%, respectivamente. Según Melman et al. (2004), la tinción de los frotis de sangre con Giemsa sólo permite detectar niveles de parasitemia del orden del 0.1- 2 %, y parasitemias menores son difíciles de diagnosticar. La microscopía de frotis sanguíneo con tinción de Giemsa es el método más común para identificar Anaplasma en animales con infección clínica. Esta técnica permite diagnosticar principalmente a los animales en fase aguda (Figueroa & Buening, 1995), sin embargo cuando el animal está en la fase crónica no expresa un elevado nivel de parasitemia como para ser detectado por la tinción (Trueblood & Palmer, 1998). En el estado de portador es difícil la observación de los organismos en un frotis sanguíneo, por lo que se hace necesario el empleo de técnicas más precisas y sensibles, tales como PCR y ELISA (Díaz et al., 2003). 4.2 PCR El sistema de PCR fue optimizado con dos volúmenes de reacción finales, de 30 y 50 µL, con una temperatura de alineamiento de 61°C, 1,5mM de MgCl2 y la adición de Sulfato de amonio 3 mM en el ensayo de 30 µL. Estos resultados difieren con los valores de optimización reportados por Tavares-Marques & Reyna-Bello (2004), donde sugieren que 85 las condiciones óptimas para la amplificación de A. marginale por PCR es 64 ºC de temperatura de alineamiento y 3 mM de MgCl2. La sensibilidad analítica de 0,0001051 ng/µL detectada en una dilución 10-7, es comparable con la descrita por varios investigadores para el diagnóstico de A. marginale. Al respecto Eriks et al. (1989), determinaron que 0.01 ng de ADN es equivalente a aproximadamente 6000 organismos. Se sabe que cada eritrocito parasitado contiene un promedio de 6- 12 organismos de A. marginale (Goff et al., 1988), esto es equivalente a 1000 eritrocitos parasitados por mL de sangre bovina. Torioni de Echaide et al. (1998), establecieron la dilución más baja de A. marginale en 10-3, con un producto primario de PCR detectable de 458 pares de bases, mientras que un producto de PCR nested con el tamaño esperado de 345 pares de bases se detectó en una dilución de 10-6. Esta sensibilidad es equivalente a 30 parásitos por mL de sangre por la PCR nested (aproximadamente 10-6 % rickettsemia). Se procesaron 181 muestras, en todos los casos que hubo amplificación, se observó una banda única de aproximadamente 200 pares de bases, de manera similar a lo obtenido por Figueroa et al. (1993b). La prevalencia de anaplasmosis detectada por PCR en los bovinos faenados muestreados en la EMRQ fue de 91,71% (165/181). Esta prevalencia es comparable con los valores reportados por Gatto et al. (2010) quienes diagnosticaron la infección por PCR utilizando primers específicos para MSP5 de A. marginale, indicando prevalencias en dos estados de la amazonia brasileña, las amplificaciones de ADN revelaron que la frecuencia media de infección por A. marginale fue del 98,6% (1627/1650) en Rondonia, y 92,87% (208/225) en Acre, estos sitios tiene condiciones similares de temperatura y humedad al área de mayor procedencia de los animales muestreados en este estudio. 86 En cuanto a la edad de los bovinos, las diferencias observadas en los grupos etarios, 0–12 meses, 13–36 meses y > 36 meses de 87,88%, 91,92% y 94,74%, respectivamente, no fueron estadísticamente significativas, mediante el test de χ2 (p>0,05). Según lo reportado por Gatto et al. (2010), las prevalencias reportadas en los estados de Rondonia y Acre no se distinguen de otras regiones de Brasil, donde la infección por A. marginale es alta e independiente de otros factores como la edad y características raciales. Con relación al sexo y a la procedencia, no se observaron diferencias estadísticamente significativas, según el test de χ2, (p>0,05). La PCR es una técnica molecular de comprobada alta sensibilidad y especificidad (Melman et al., 2004). La amplificación del ADN de la bacteria tiene ventajas sobre otros métodos para la detección en animales persistentemente infectados con A. marginale, porque es difícil de detectar por los métodos de diagnóstico convencionales cuando el animal tiene bajos niveles de parasitemia (Melman et al., 2004). Herrero et al. (1998) realizaron un estudio por PCR para la detección de A. marginale en Costa Rica, planteando que la PCR puede detectar bajos niveles de parasitemia en los animales persistentemente infectados, que no pueden ser detectados por los métodos convencionales. Figueroa et al. (1993b), realizaron un PCR múltiple donde analizan los productos por hibridación con una sonda no radioactiva y encontraron que la sensibilidad fue de 0.00001 % para B. bovis y B. bigemina y 0.0001 % para A. marginale. Este sistema se utilizó posteriormente para estudios epidemiológicos en México y reportó en 420 muestras evaluadas una prevalencia de 59.6 % para A. marginale (Figueroa et al., 1993b). La utilización del PCR en el diagnóstico de A. marginale permite avances significativos no solo en el diagnóstico de la enfermedad, permitiendo diseñar métodos de diagnóstico altamente eficientes (Melman et al., 2004), sino también en estudios epidemiológicos (Figueroa et al., 1993a, 1998b). Además, la PCR puede ser recomendado 87 para determinar la presencia de la rickettsia en animales de exposiciones y ferias, sementales y animales donadores de embriones, cuando se requiera el traslado de los mismos, también puede ayudar a monitoreos de programas de lucha integrada de garrapatas y enfermedades asociadas. Sin embargo el uso de la PCR, para estudios epidemiológicos a gran escala sigue siendo limitante por su elevado costo y solo se aplica a proyectos de investigación (Torioni & Echaide, 2003). 4.3 cELISA Las pruebas serológicas son de gran importancia para estudios epidemiológicos, la aplicación de estas resulta relevante en lugares donde se practique el control intensivo de garrapatas, en los centros de inseminación y transferencia de embriones, así como en los lugares donde se produzcan animales de elite o reproductores puros, relacionados también con la industria lechera. El diagnóstico serológico incluye pruebas como fijación del complemento, aglutinación en tubos capilares, aglutinación rápida en tarjeta, ensayos de IFI, y las pruebas Dot-ELISA y ELISA. Las pruebas serológicas como fijación del complemento y aglutinación en tarjeta, son los métodos más comúnmente utilizados para detectar animales infectados con A. marginale en el campo y fueron métodos aceptados para el movimiento de animales a nivel internacional (Word Organization for Animal Health, 2000). Todos estos ensayos para la detección de anticuerpos utilizan antígenos crudos obtenidos de A. marginale parcialmente purificado, lo que provoca que se pierda la sensibilidad y especificidad que se requiere para un diagnóstico eficaz (Kocan et al., 1996). Para mejorar los parámetros de sensibilidad y especificidad se han desarrollado técnicas de diagnóstico utilizando anticuerpos monoclonales (Trueblood et al., 1991) y antígenos recombinantes (Knowles et al., 1996; Torioni et al., 1998). El establecimiento de 88 un ensayo de ELISA competitivo (Torioni et al., 1998), utilizando la proteína recombinante MSP5, permitió el incremento de la sensibilidad a un 96 % y la especificidad de un 95 %, pudiendo detectar las infecciones persistentes de la rickettsia. La obtención de la proteína MSP5 de forma recombinante se hace necesario, pues la proteína nativa está representada en poca cantidad en el cuerpo inicial de A. marginale y su purificación se realiza a partir de sangre de bovino infectada, que además tiene como inconveniente la contaminación con proteínas del estroma del glóbulo rojo y con proteínas de otros patógenos que pudieran estar presentes en la sangre (McGuire et al., 1984). Para la detección de Ac contra A. marginale se utilizó el kit de identificación por ELISA competitivo, Anaplasma Antibody Test Kit cELISA (VMRD Inc.) La interpretación de los resultados del cELISA se basa en el valor del punto de corte entre los bovinos positivos y negativos, tomando un valor mayor o igual al 30% de inhibición de la reacción de un Ac monoclonal acoplado a la peroxidasa de rábano con el Ag fijado en los pocillos de las placas de cELISA como resultado positivo, este porcentaje es comparable con el punto de corte seleccionado por Torioni de Echaide et al. (1998), que fue del 28% de inhibición considerado como el umbral que mejor discrimina a bovinos infectados y no infectados, además Knowles et al. (1996) determinaron que el porcentaje de inhibición que representa un resultado positivo cELISA es a partir de >25%. Mediante la técnica de cELISA se analizaron 181 muestras de suero de bovinos faenados en la EMRQ, la prevalencia detectada fue de 91,16 %. Este resultado es comparable con la prevalencia determinada en el estado Guárico-Venezuela de 93,7% por Elizalde et al. (2007), donde emplea un ELISA indirecto utilizando la MSP5 recombinante como Ag. A través del análisis estadístico se pudo comprobar que la presencia o ausencia de la enfermedad no está asociada con la edad, el sexo y la procedencia del ganado. 89 Los grupos etarios no tuvieron una significancia estadística, mediante el test de χ2 (p>0,05), lo que demuestra que la infección con A. marginale es independiente del parámetro edad. Madruga et al. (2000), también determinó que la prevalencia de anticuerpos contra A. marginale es independiente de la raza del bovino, y que después de cuatro meses, es independientemente de la edad. A pesar de la inestabilidad enzoótica, la edad no tiene influencia sobre la situación epidemiológica. En un estudio realizado por Birdane et al. (2006) se observó que las infecciones clínicas se asociaron significativamente con la edad, los resultados muestran que el ganado de todas las edades (<9 meses, 9-12 meses, 1-2, 2-3, 3-4, >4 años), con excepción de 9-12 meses, está infectado con A. marginale. Sin embargo, la gravedad de la enfermedad y el porcentaje de muertes aumenta con la edad. Con relación al sexo tampoco se observaron diferencias significativas, (p>0,05), coincidiendo con Díaz et al. (2003), que utilizando la técnica de Inmunofluorescencia indirecta determinó la seroprevalencia de Anaplasma marginale en machos y hembras de 93,75% y 96,03%, respectivamente, sin presentar diferencias significativas (p>0,05). No se observan diferencias significativas en la prevalencia entre las provincias (p>0,05). Al comparar los resultados obtenidos de PCR con los obtenidos por cELISA, se obtuvo 160 bovinos diagnosticados como positivos a A. marginale por ambas técnicas y 10 como negativos, los 11 bovinos restantes difieren en su diagnóstico, pues 6 de las muestras resultaron positivas por PCR y negativas por cELISA, y las 5 muestras restantes fueron negativas por PCR y positivas por cELISA. El primer caso, podría deberse a que los animales se encuentran en las primeras semanas de infección, período en el que se liberan anticuerpos del tipo IgM (Roitt & Delves, 2003; Tizard, 1995), por lo que los anticuerpos no son detectados por el cELISA, pues éste solo detecta anticuerpos del tipo IgG, otros ELISAs detectan anticuerpos de tipo IgM. En el segundo caso, en el que las muestras 90 negativas por PCR resultaron positivas por ELISA, pudiera deberse al hecho de que una vez que los animales sobreviven la fase aguda de la enfermedad, entran en un estado portador en el que la bacteria se hace imperceptible por métodos directos; sin embargo, la síntesis de anticuerpos se mantiene, estableciendo un equilibrio entre el número de bacterias y la respuesta inmune (Kieser et al., 1990 & Knowles et al., 1996). La técnica de cELISA presentó sensibilidad de 96,39%, especificidad de 66,67%, valor predictivo positivo de 96,97% y valor predictivo negativo de 62,50%. Es decir, utilizando esta técnica se clasificaron correctamente como enfermos al 96,392% de los que padecieron anaplasmosis y como sanos al 66,67% de los que no se encontraban enfermos de anaplasmosis. En cuanto a los valores predictivos, el positivo significa que en un 96,97% de los bovinos con anaplasmosis finalmente se confirmó la presencia de anticuerpo de A. marginale, mientras que de los que no se detectaron la presencia de la enfermedad un 62,50% estaban efectivamente sanos. La sensibilidad obtenida es similar a la reportado por Torioni de Echaide et al. (1998), que con un corte de la inhibición del 28%, determinó la sensibilidad del cELISA de 96% y a otras pruebas serológicas para la anaplasmosis, incluyendo aglutinación en placa y fijación del complemento, que han informado las sensibilidades de 84 y 79%, respectivamente (Gonzalez et al., 1978). En cuanto a la especificidad y al valor predictivo negativo, estos valores fueron inferiores a los reportados por Torioni de Echaide, et al. (1998), que determino una especificidad de 95% y valor predictivo negativo de 93%. Estos resultados corroboran los reportes de otras investigaciones donde ha demostrado ser una prueba sensible y específica para la anaplasmosis y especialmente útil para la identificación de infecciones persistentes en el ganado portador. El cELISA utilizando la MSP5 fue utilizado con éxito en varios países, incluyendo Sudáfrica (Dreyer et al., 1998), Costa Rica (Herrero et al, 1998), Venezuela (ReynBello et al., 1998), Marruecos (Sahibi et al., 1998), Brasil (Vidotto et al., 1998), los Estados Unidos (Toriani de Echaide et al., 1998) y Australia (Molloy et al., 1999). Esta prueba debe ser un excelente 91 sustituto de la prueba de fijación del complemento, que es actualmente la prueba de serodiagnóstico aprobados por el Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (USDA) para la anaplasmosis en los EE.UU. Molloy et al. (1999) concluyeron que la técnica de cELISA es una prueba de serodiagnóstico alternativa a la prueba de aglutinación en placa para la detección de la infección A.marginale en el ganado bovino y debe ser útil para aplicaciones tales como estudios epidemiológicos de prevalencia y los programas de control. 4.4 Consideraciones generales sobre la edad, sexo y procedencia de los bovinos En general el ganado puede contraer anaplasmosis a cualquier edad, aunque la edad, constituye el determinante de la gravedad de la enfermedad, es decir la mortalidad y severidad aumentan con la misma. Los terneros de madres inmunes reciben protección especial del calostro que impide la anaplasmosis, esta protección dura aproximadamente 3 meses y en la mayoría de los casos, es seguido por una resistencia de la edad, que dura hasta la edad de 9 a 12 meses (Kocan et al., 2000). Lo que se ha demostrado mediante PCR es que animales menores de 3 meses son portadores de la rickettsia aún cuando no presentan signos clínicos, los mecanismos que evitan la presentación de los signos clínicos se desconocen (Cossio-Bayúgar et al., 1997). El ganado entre 6 meses y tres años comienza a incrementar el padecimiento y ocurren más muertes con el avance de la edad (Corona, 2004). La anaplasmosis no está influenciada por el sexo, según Rodríguez et al. (2003), la resistencia en relación al sexo se ha reportado más en virtud del daño que la enfermedad ocasiona en sementales los cuales pierden su capacidad para reproducirse, que en términos de verdadera resistencia de un sexo sobre otro a la anaplasmosis. 92 Con respecto a la procedencia la detección de bovinos infectados es importante para controlar el movimiento de ganado infectado a regiones libres de la enfermedad. Entre las condiciones que contribuyen a la presentación de brotes de anaplasmosis han sido reportadas las siguientes: El movimiento de ganado de un hato con baja prevalencia de infección a uno de alta (Corrier, 1975), introducción de ganado infectado con Anaplasma o de garrapatas infectadas dentro de una zona libre de garrapatas (Jongejan et al., 1998) e introducción de ganado susceptible a garrapatas y Anaplasma dentro de zonas endémicas de Anaplasma. Finalmente, es importante resaltar la alta prevalencia de la enfermedad, el 91% de los animales resultaron positivos a la anaplasmosis, lo cual da testimonio de la necesidad de encontrar un mecanismo de control para esta enfermedad. Diferentes autores, han estudiado el comportamiento de la anaplasmosis bovina, encontrándose variaciones en la prevalencia, como por ejemplo 1,17 a 2,49% en Suiza (Dreher et al., 2005), 0,89% en las regiones áridas y montañosas de Arabia Saudí (El-Metenawy, 2000), un estudio realizado en el norte de Veracruz (México), mostró que el 69 % del ganado estaba infectado (Cossio et al., 1997). En el año 2000 en Argentina, se reportó la existencia de un rebaño donde el 50 % de los animales tenía Ac contra A. marginale por la prueba de aglutinación en tarjeta y en el año 2003 se reportó una alta incidencia de la anaplasmosis, a pesar de no ser una enfermedad de declaración obligatoria (Spath, 2003), en Venezuela se observó una muy alta incidencia de la enfermedad (Melendez & Forlano, 1997) y en el estado de Paraná, en Brasil, se reportaron valores de 87.6 % de animales positivos en una región donde la anaplasmosis es endémica (Vidotto et al., 1998). 4.5 Comparación entre las técnicas Las pruebas diagnósticas utilizadas para identificar A. marginale tienen características particulares, dentro de estas características cabe mencionar el funcionamiento, la sensibilidad, la complejidad y el costo de cada una. Por ejemplo la 93 microscopía de frotis sanguíneo y la PCR reconocen directamente la presencia de la rickettsia, mientras que el cELISA a diferencia, mide la respuesta humoral de un bovino hacia la rickettsia. La presencia de Ac de A. marginale no necesariamente indican que el bovino este enfermo, es posible que estos Ac se deben a una infección previa. Las ventajas y desventajas de cada prueba, principalmente en lo que se refiere a los criterios de fiabilidad, deben tomarse en cuenta al momento de seleccionar una técnica diagnostica para uso rutinario. El objetivo general de esta investigación fue el de conocer la prevalencia de anaplasmosis en el ganado faenado en la EMRQ, ya sea que detecten la rickettsia o los anticuerpos, por lo que es válido comparar las diversas pruebas diagnósticas para A. marginale. Realizando la comparación entre los resultados de microscopía de frotis sanguíneo, PCR y cELISA (Tabla 3.7.), se determinó que la 1 muestra, No. 81 (ver Anexo C), cuyo diagnóstico es positiva a microscopía de frotis sanguíneo y negativa a PCR y cELISA, es un resultado falso positivo, ya que es más probable que A. marginale pudó ser confundida por residuos de colorante u otras estructuras, a pesar del valor predicitivo positivo de la técnica de 94,12%. Asimismo teniendo en cuenta el valor predictivo negativo relativamente bajo de la microscopía de frotis sanguíneo de 9,93%, las 3 muestras (No. 111, 139, 342) y las 4 muestras (No. 91, 231, 256, 307), serán consideradas como positivas, ya que la probabilidad de que sean realmente negativas es muy baja. Al comparar las dos técnicas validadas con respecto a la PCR, se obtuvo valores de sensibilidad de 28,92% para Microscopía de frotis sanguíneo y 96,39% para cELISA, indicando que el cELISA es la técnica con mayor capacidad para detectar la enfermedad. La especificidad de la microscopía de frotis sanguíneo tuvo valor de 80%, superior a la especificidad de 66,67% para la técnica de cELISA, demostrando que está técnica tiene mayor capacidad para detectar a los bovinos sanos. Con relación a los valores predictivos de las técnicas, el predictivo positivo del cELISA de 96,97% es superior al predictivo 94 positivo de la microscopía de frotis sanguíneo de 94,12%, demostrando que esta técnica tiene mayor habilidad para confirmar la presencia de la enfermedad, y el predictivo negativo de cELISA de 62,50% es superior al valor predictivo negativo de la microscopía de frotis sanguíneo de 9,23%, señalando q el cELISA tiene la mayor capacidad para detectar, si la prueba es negativa a los bovinos que estuvieron sanos. Con respecto a la concordancia entre las técnicas, el porcentaje observado entre cELISA y PCR de 93,92% fue superior a los porcentajes observados entre microscopía de frotis sanguíneo y PCR de 33,15% demostrando un alto grado de concordancia y alta asociación entre las dos técnicas. Un total de 34 muestras fueron enviadas al Centro de estudios Biomédicos y veterinarios de la Universidad Nacional Experimental Simón Rodríguez-IDECYT, Venezuela, para confirmar su diagnóstico, los sueros fueron analizados con un ELISA indirecto (iELISA). En el Tabla 3.10., se expone los resultados de las 4 técnicas: Microscopía de frotis sanguíneo, PCR, cELISA y iELISA, observándose que de las 34 muestras, 11 (32,35%) fueron positivas por las cuatro técnicas. Asimismo al realizar la comparación entre los resultados de microscopía de frotis sanguíneo, PCR, cELISA y iELISA se determinó que las 8 muestras serán consideradas como positivas por microscopía de frotis sanguineo, debido al valor predictivo negativo muy bajo de la técnica. 4.6 Anaplasmosis en el Ecuador Para determinar la prevalencia de anaplasmosis en el Ecuador, se ha utilizado la microscopía de frotis sanguíneo con tres tipos de colorante Giemsa, Wright y naranja de acridina y una técnica serológica, la primera en el país, la aglutinación capilar. La microscopía de frotis sanguíneo con tinción Giemsa ha sido la técnica más empleada en el país para la detección de Anaplasma spp., las prevalencias determinadas en las provincias de Guayas, Manabí y Sto. Domingo de los Tsachilas fueron realizadas con está técnica. Para Guayas, se han obteniendo porcentajes de 50,05 (Luque, 1961); 40 95 (Herrera, 1997); 17,5; (Villafuerte, 2001) y 9 (Arreaga, 2004), para Manabí, prevalencias de 29,5% (Cueva, 2000) y 65,2% (Villamil, 2005) en los cantones de Paján y Chone, respectivamente y para Sto. Domingo de los Tsachilas prevalencias de 6,67% (Martínez, 1975) y 28,6% (Rosillo, 1996). La microscopía de fluorescencia con tinción de naranja de acridina, han sido utilizada, obteniendo una prevalencia de 8,89% para la provincias de Sto. Domingo de los Tsachilas (Martínez, 1975). La prevalencia de Manabí de 43% ha sido determinada con microscopía con tinción Wright (Benítez, 2003). La prueba de aglutinación capilar, ha sido usada en las provincias de Pichincha, Sto. Domingo de los Tsachilas y Guayas, obteniendo prevalencias de 27,50%, 62,85% y 100%, respectivamente (Balda, 1968 & Pérez, 1998). Esta técnica es un método simple para detectar portadores de Anaplasma, aunque limitada en su sensibilidad, es sencilla, de aplicación directa en el campo y no requiere de anticuerpos secundarios ni de equipo alguno en su aplicación. En estudios realizados en otros países se han reportado ser poco sensible y poco especifica. La aglutinación capilar ha sido usada para determinar la prevalencia de portadores en varios países como Perú, México y Venezuela y aplicada a otros hemoparásitos como Babesia bigemina mediante el uso de antígenos específicos. Sin embargo, no ha sido ampliamente difundida en Venezuela y en otros países, probablemente debido a que la preparación del material antigénico requiere de reactivos y equipos apropiados de laboratorios más especializados. Los animales muestreados, en todos los trabajos realizados en el Ecuador, han sido realizados en haciendas ganaderas de doble propósito, de determinados cantones de cada provincia. 96 Como se puede observar en la Tabla 3.11., anteriormente en el país, no se han utilizados pruebas de alta sensibilidad y especificidad como las utilizadas en esta investigación (PCR y cELISA), lo cual podrían haber dado una idea errónea de la verdadera prevalencia de la enfermedad en los bovinos especialmente de la zona de la costa, pues justamente como se señala en esta investigación la prevalencia reportada por microscopía de frotis sanguíneo es baja, en relación a la reportada por la otras dos pruebas. De ahí la importancia de implementar pruebas de diagnóstico más confiables, para de esta forma tener una apreciación lo más aproximada a la realidad y de esta forma poder establecer mecanismos y programas de control para esta enfermedad. 97 CAPÍTULO 5: CONCLUSIONES La prevalencia de anaplasmosis en el ganado bovino muestreado en la Empresa Metropolitana de Rastro de Quito (EMRQ), fue de 91,71% y 91,16% por medio de las técnicas PCR y cELISA, respectivamente, mientras que a través de la microscopía de frotis sanguíneos fue de 28,18%. La prevalencia de anaplasmosis determinada en el ganado muestreado en la EMRQ presentó una variación significativa en relación a las prevalencias reportadas en estudios de campo en la costa del Ecuador cuyas cifras reportadas van desde 6,67% al 65,20%. No se detectaron, diferencias significativas en los valores de prevalencia de A. marginale determinadas por PCR y cELISA, con respecto a la edad, sexo y procedencia de los animales, por lo cual se podría suponer que estos factores no predisponen o determinan la presencia o ausencia de la enfermedad en los bovinos muestreados en la EMRQ. La técnica de microscopía de frotis sanguíneo, por su valor predictivo positivo alto, se puede usar para confirmar la presencia de Anaplasma, cuando no se disponga de técnicas de alta sensibilidad y especificidad como son la PCR y el cELISA. La técnica de PCR fue optimizada para la identificación de A. marginale y por su límite de detección de 0,00001051 ng/µL de ADN genómico de este hemoparásito detectó un mayor número de animales positivos en relación a las demás pruebas empleadas, por lo que se debería implementar su uso en el diagnóstico. 98 La técnica de cELISA podría ser usada como prueba de screening en trabajos epidemiológicos debido a su alta sensibilidad y especificidad, bajo costo y su relativamente fácil implementación. 99 CAPÍTULO 6: RECOMENDACIONES Realizar estudios a nivel nacional especialmente en la costa y oriente ecuatoriano para determinar la situación real de la enfermedad en hatos ganaderos, además de su epidemiología, clínica y vectores. Profundizar las investigaciones sobre la capacidad de transmisión de A. marginale por vectores mecánicos y biológicos, así como otros factores epidemiológicos asociados con la enfermedad a fin de poder establecer eficaces medidas de control. Implementar como medida de control en cada establecimiento, la realización de pruebas serológicas antes de la movilización de animales. Implementar programas de desparasitación de ectoparásitos periódica de todos los animales que ingresen a los hatos ganaderos y ferias. Efectuar campañas de información de las diferentes enfermedades en bovinos, especialmente en anaplasmosis (diagnóstico, manejo y tratamiento), dirigida a los criadores de ganado bovino, para así evitar que el problema infeccioso se incremente. 100 CAPÍTULO 7: BIBLIOGRAFÍA Aboytes-Torres, R. & Buening G. 1990. Development of a recombinant Anaplasma marginale DNA probe. Vet. Microbiol. 24: 391-408. Alcaraz, E. 1999. Anaplasmosis Bovina. Extraído el 10 febrero del 2009 de: www.produccion- animal.com.ar Alfaro, C., Toro, M., García, F. & Valle, A. 1998. Epidemiología de la anaplasmosis bovina en el estado Monagas. Asociación con factores extrínsecos e intrínsecos del hospedador. 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Arreo: Consiste en la movilización de los animales desde los corrales hasta las mangas de duchado. 3. Duchado: En esta etapa los animales son sometidos a un baño por aspersión en agua potabilizada. 4. Noqueo: Los animales son insensibilizados mediante métodos físicos o eléctricos para facilitar su proceso y evitar sufrimiento animal. 5. Izado: Los animales son suspendidos a un sistema aéreo de rielería para facilitar las operaciones subsecuentes. 6. Sangrado: Consiste en el seccionamiento transversal del paquete vascular a nivel del cuello para producir un sangrado profuso. 7. Degüello: Esta etapa consiste en separar la cabeza del cuerpo del animal. 8. Escaldado: Etapa usada para el desprendimiento de pelo y cerdas de los porcinos mediante la utilización de agua caliente por un tiempo determinado. 9. Corte de Patas: En esta etapa se procede a cortar y separar las extremidades anteriores y posteriores del cuerpo del animal. 10. Insuflado: Consiste en la aplicación subcutánea de aire para facilitar el desollado. 11. Desollado: En esta etapa se desprende la piel del animal mediante métodos manuales y/o mecánicos. 12. Depilado: En esta etapa se procede a desprender la cerda o pelo de los porcinos mediante métodos manuales o mecánicos. 121 13. Eviscerado: El operario procede a extraer los órganos internos de cada animal. 14. Fisurado: Consiste en la incisión longitudinal del esternón y la columna vertebral mediante una sierra eléctrica, neumática o de forma manual. 15. Inspección Veterinaria Post mortem: Los animales y sus vísceras son revisados prolijamente por el veterinario para determinar su integridad orgánica y estado sanitario. 16. Lavado de Canales: Consiste en la aplicación a presión de agua potabilizada sobre las superficies corporales de cada canal. 16.1 Desinfección de Canales: Consiste en la aplicación mediante aspersión de una mezcla de ácidos orgánicos sobre las superficies corporales de cada canal. 17. Cuarteo: En esta etapa las medias canales son seccionadas transversalmente manual o mecánicamente para la formación de cuartos de canal. 18. Oreo: Las canales son sometidas a la acción medio ambiental para lograr su máxima deshidratación e inicio de los procesos de transformación del músculo a carne. 19. Transporte: Las canales y vísceras son transportadas hacia los distintos centros de acopio y comercialización. 122 Anexo B. Electroforesis horizontal en geles de agarosa al 2% 1. Pesar 1,6 g de agarosa y disolver en 80 mL de buffer TAE 1X. 2. Hidratar por 10 minutos con agitación constante. 3. Calentar la mezcla en el microondas durante un minuto. 4. Colocar nuevamente a agitación 5. Volver a calentar en el microondas por un minuto. 6. Homogenizar con agitación hasta que la temperatura sea de 55 ° C aproximadamente. 7. Añadir 5 µL de bromuro de etidio por cada 100 mL de buffer TBE 1X, mantener la agitación hasta homogenizar la mezcla. 8. Dispensar el gel en la cubeta previamente armada y con la peineta y esperar que el gel se solidifique 9. Retirar la peineta y colocar el gel dentro de la cámara de electroforesis, que debe contener buffer TBE 1 a 10 X 10. Cargar las muestras en los pocillos adicionando a cada uno 0,2 µL de buffer de carga a 10 µL de la muestra, también cargar un marcador de peso molecular de 100 pb. 11. La corrida electroforética se realiza a 120 V durante una hora. 12. Los resultados obtenidos se observan en un transiluminador mediante luz ultravioleta a una longitud de onda de 365 nm. 123 Anexo C. Información general de los bovinos muestreados en la Empresa Metropolitana de Rastro de Quito (EMRQ). Procedencia años meses Provincia 1 76 M 2 24 S. D. Tsachilas positivo positivo positivo 2 77 M 1 12 S. D. Tsachilas negativo positivo positivo 3 79 M 2 24 Cotopaxi negativo positivo positivo 4 80 M 3 36 S. D. Tsachilas negativo positivo positivo 5 81 M 1 12 Cotopaxi positivo negativo negativo 6 84 H 4 48 S. D. Tsachilas negativo positivo positivo 7 85 M 2 24 S. D. Tsachilas negativo positivo positivo 8 87 M 1 12 Pichincha negativo positivo positivo 9 89 M 2 24 Pichincha negativo negativo negativo 10 90 M 2 24 S. D. Tsachilas negativo positivo positivo 11 91 M 2 24 S. D. Tsachilas negativo positivo negativo 12 92 M 1 12 Manabí positivo positivo positivo 13 93 M 2 24 Orellana positivo positivo positivo 14 95 H 1 12 S. D. Tsachilas negativo positivo positivo 15 97 M 3,5 42 Pichincha negativo negativo negativo 16 98 M 1 12 S. D. Tsachilas negativo positivo positivo 17 99 M 2 24 S. D. Tsachilas negativo positivo positivo 18 102 M 1,5 18 S. D. Tsachilas negativo positivo positivo 19 103 H 3 36 Pichincha negativo positivo positivo 20 104 M 1 12 S. D. Tsachilas negativo positivo positivo 21 106 M 2 24 Orellana negativo negativo negativo 22 107 M 3 36 S. D. Tsachilas negativo positivo positivo 23 110 M 2 24 Orellana negativo positivo positivo 24 111 H 4 48 Pichincha negativo negativo positivo 25 112 M 4 48 Cotopaxi negativo positivo positivo 26 113 M 2 24 Cotopaxi negativo positivo positivo 27 114 M 4 48 S. D. Tsachilas negativo positivo positivo 28 115 H 2,5 30 Esmeraldas negativo positivo positivo 29 117 M 3,5 42 S. D. Tsachilas negativo positivo positivo 30 118 H 10 120 Manabí positivo positivo positivo 31 119 H 2 24 Orellana negativo positivo positivo 32 122 M 2 24 S. D. Tsachilas negativo positivo positivo 33 123 M 2 24 Sucumbios negativo positivo positivo 34 124 M 2 24 Cotopaxi negativo positivo positivo 35 125 M 2 24 S. D. Tsachilas positivo positivo positivo 36 126 M 1 12 S. D. Tsachilas negativo positivo positivo 37 127 M 4 48 Orellana negativo positivo positivo 38 128 M 2 24 Esmeraldas negativo positivo positivo 39 129 M 3 36 S. D. Tsachilas negativo positivo positivo 40 130 M 2 24 S. D. Tsachilas negativo positivo positivo cELISA Edad No. No. muestra Sexo Microscopía de frotis sanguíneo PCR 124 41 131 M 4 48 S. D. Tsachilas negativo positivo positivo 42 132 M 2 24 S. D. Tsachilas negativo positivo positivo 43 134 M 5 60 S. D. Tsachilas negativo positivo positivo 44 136 M 2 24 Esmeraldas negativo positivo positivo 45 138 M 2 24 Orellana negativo positivo positivo 46 139 M 2 24 Pichincha negativo negativo positivo 47 140 M 1 12 Manabí negativo positivo positivo 48 141 M 2 24 Cotopaxi negativo negativo negativo 49 142 M 1,5 18 S. D. Tsachilas negativo positivo positivo 50 143 M 1 12 S. D. Tsachilas negativo negativo negativo 51 144 M 2 24 S. D. Tsachilas negativo positivo positivo 52 145 M 4 48 S. D. Tsachilas negativo positivo positivo 53 146 M 4 48 S. D. Tsachilas negativo negativo negativo 54 147 M 2 24 Esmeraldas negativo positivo positivo 55 148 M 4 48 Pichincha negativo positivo positivo 56 151 M 3 36 Orellana negativo positivo positivo 57 152 M 6 72 Esmeraldas positivo positivo positivo 58 153 M 11 132 Esmeraldas negativo positivo positivo 59 154 M 4 48 S. D. Tsachilas positivo positivo positivo 60 155 M 2 24 S. D. Tsachilas positivo negativo positivo 61 156 H 3,5 42 Orellana positivo positivo negativo 62 157 H 4 48 Orellana positivo positivo positivo 63 158 M 1,5 18 Orellana negativo positivo positivo 64 161 M 1 12 S. D. Tsachilas negativo positivo positivo 65 162 M 3 36 Esmeraldas negativo positivo positivo 66 168 M 3 36 Orellana negativo positivo positivo 67 169 H 4 48 Orellana positivo positivo negativo 68 172 M 1,5 18 Pichincha negativo positivo positivo 69 173 H 1 12 S. D. Tsachilas positivo negativo positivo 70 174 H 1 12 S. D. Tsachilas positivo positivo positivo 71 181 M 3 36 Orellana negativo positivo positivo 72 182 H 4 48 Cotopaxi negativo positivo positivo 73 184 M 2 24 S. D. Tsachilas negativo positivo positivo 74 187 M 4 48 S. D. Tsachilas negativo positivo positivo 75 188 M 2 24 S. D. Tsachilas negativo positivo positivo 76 189 H 4 48 Esmeraldas positivo positivo positivo 77 191 M 1 12 S. D. Tsachilas positivo positivo positivo 78 195 M 1 12 S. D. Tsachilas negativo positivo positivo 79 197 M 1 12 Cotopaxi negativo positivo positivo 80 198 H 1 12 S. D. Tsachilas positivo positivo positivo 81 201 M 2,5 30 Pichincha negativo positivo positivo 82 203 M 1 12 Manabí negativo positivo positivo 83 204 M 1 12 Cotopaxi negativo positivo positivo 84 205 M 2 24 Orellana positivo positivo positivo 85 206 M 4 48 Manabí positivo positivo positivo 86 207 H 4 48 Pichincha negativo positivo positivo 87 209 M 4 48 Manabí negativo positivo positivo 88 210 M 3,5 42 Esmeraldas negativo positivo positivo 89 211 M 4 48 S. D. Tsachilas negativo positivo positivo 90 212 M 2 24 S. D. Tsachilas negativo positivo positivo 91 213 M 1,5 18 Pichincha negativo positivo positivo 92 214 M 2 24 S. D. Tsachilas negativo positivo positivo 93 215 M 3 36 S. D. Tsachilas negativo positivo positivo 94 216 M 3 36 S. D. Tsachilas negativo positivo positivo 95 218 H 4 48 S. D. Tsachilas negativo positivo positivo 125 96 220 M 3 36 S. D. Tsachilas negativo positivo positivo 97 222 M 4 48 Manabí negativo positivo positivo 98 223 M 4 48 S. D. Tsachilas positivo positivo positivo 99 224 H 4 48 S. D. Tsachilas positivo positivo positivo 100 226 M 2 24 Pichincha negativo positivo positivo 101 228 M 2 24 S. D. Tsachilas positivo positivo positivo 102 229 H 3,5 42 S. D. Tsachilas positivo positivo positivo 103 230 H 4 48 S. D. Tsachilas negativo positivo positivo 104 231 H 4 48 Pichincha negativo positivo negativo 105 233 M 2 24 Pichincha negativo positivo positivo 106 234 M 3 36 Pichincha negativo negativo negativo 107 235 M 1,5 18 Cotopaxi negativo positivo positivo 108 237 M 2 24 Sucumbios negativo positivo positivo 109 238 M 2 24 S. D. Tsachilas positivo positivo positivo 110 240 M 4 48 S. D. Tsachilas positivo positivo positivo 111 243 M 3 36 S. D. Tsachilas negativo positivo positivo 112 244 M 2 24 S. D. Tsachilas negativo positivo positivo 113 245 M 4 48 Pichincha negativo positivo positivo 114 248 M 3 36 Orellana positivo positivo positivo 115 250 M 4 48 Manabí negativo positivo positivo 116 255 M 4 48 S. D. Tsachilas positivo positivo positivo 117 256 H 3,5 42 Pichincha negativo positivo negativo 118 257 M 4 48 S. D. Tsachilas negativo positivo positivo 119 258 H 4 48 Manabí negativo positivo positivo 120 259 M 4 48 Manabí positivo positivo positivo 121 261 M 2 24 S. D. Tsachilas negativo negativo negativo 122 265 M 4 48 S. D. Tsachilas positivo positivo positivo 123 274 M 2 24 Esmeraldas negativo positivo positivo 124 275 M 1,5 18 S. D. Tsachilas negativo positivo positivo 125 276 M 1,5 18 S. D. Tsachilas negativo positivo positivo 126 281 H 4 48 S. D. Tsachilas negativo positivo positivo 127 282 M 2 24 S. D. Tsachilas negativo positivo positivo 128 286 M 2 24 Orellana positivo positivo positivo 129 289 M 3 36 Esmeraldas negativo positivo positivo 130 290 H 6 72 Manabí positivo positivo positivo 131 291 H 1,5 18 Pichincha negativo positivo positivo 132 292 M 2,5 30 Pichincha negativo positivo positivo 133 293 M 1 12 Manabí positivo positivo positivo 134 295 M 3,5 42 S. D. Tsachilas negativo positivo positivo 135 296 H 3,5 42 S. D. Tsachilas negativo positivo positivo 136 297 H 3,5 42 S. D. Tsachilas negativo positivo positivo 137 298 M 1,5 18 Pichincha negativo positivo positivo 138 299 M 1,5 18 Pichincha negativo positivo positivo 139 300 M 1,5 18 Pichincha positivo positivo positivo 140 301 M 2 24 Cotopaxi negativo positivo positivo 141 303 M 4 48 Cotopaxi negativo positivo positivo 142 305 M 1 12 Cotopaxi negativo positivo positivo 143 307 M 1 12 S. D. Tsachilas negativo positivo negativo 144 310 M 2 24 S. D. Tsachilas negativo positivo positivo 145 311 M 2 24 Orellana negativo positivo positivo 146 313 M 2 24 Orellana positivo positivo positivo 147 314 M 2 24 Pichincha negativo positivo positivo 148 315 M 3 36 S. D. Tsachilas negativo positivo positivo 149 316 M 1 12 S. D. Tsachilas positivo positivo positivo 150 318 M 3 36 Pichincha positivo positivo positivo 126 151 319 M 1 12 Esmeraldas positivo positivo positivo 152 320 M 2 24 S. D. Tsachilas negativo positivo positivo 153 321 M 2 24 Pichincha negativo positivo positivo 154 322 H 4 48 S. D. Tsachilas positivo positivo positivo 155 323 M 3 36 Manabí negativo positivo positivo 156 324 M 1 12 S. D. Tsachilas negativo positivo positivo 157 326 H 2 24 Esmeraldas positivo positivo positivo 158 327 H 1 12 S. D. Tsachilas negativo positivo positivo 159 330 H 1 12 S. D. Tsachilas negativo positivo positivo 160 332 M 3 36 S. D. Tsachilas negativo positivo positivo 161 333 M 1,5 18 S. D. Tsachilas negativo positivo positivo 162 334 M 1 12 S. D. Tsachilas negativo positivo positivo 163 337 M 2 24 Orellana positivo positivo positivo 164 338 H 2,5 30 Manabí positivo positivo positivo 165 339 M 3 36 S. D. Tsachilas positivo positivo positivo 166 341 M 1 12 S. D. Tsachilas positivo positivo positivo 167 342 M 1 12 Pichincha negativo negativo positivo 168 346 M 2 24 S. D. Tsachilas negativo negativo negativo 169 347 M 2 24 Manabí positivo positivo positivo 170 348 M 1 12 Manabí negativo positivo positivo 171 349 M 1 12 S. D. Tsachilas negativo positivo positivo 172 351 H 4 48 Pichincha positivo positivo positivo 173 352 M 2 24 S. D. Tsachilas negativo positivo positivo 174 355 H 4 48 Manabí negativo positivo positivo 175 357 H 6 72 S. D. Tsachilas negativo positivo positivo 176 358 H 5 60 S. D. Tsachilas negativo positivo positivo 177 360 H 9 108 S. D. Tsachilas positivo positivo positivo 178 362 H 7 84 S. D. Tsachilas positivo positivo positivo 179 364 H 3 36 S. D. Tsachilas positivo positivo positivo 180 365 M 1 12 S. D. Tsachilas negativo positivo positivo 181 416 H 4 48 Orellana positivo positivo positivo Microscopía de frotis sanguíneo y PCR: Positivo (presencia de A. marginale ), Negativo (ausencia de A. marginale ) cELISA: Positivo (presencia de anticuerpos IgG de A. marginale ), Negativo (ausencia de anticuerpos IgG de A. marginale ) 127 Anexo D. Abreviaturas A. marginale Anaplasma marginale A.centrale Anaplasma centrale Ac Anticuerpo ADN Ácido desoxiribonucleico Ag Antígeno ARN Ácido ribonucleico cELISA Ensayo inmunoenzimático competitivo D.O. Densidad óptica dNTPs Desoxiribonucleótidos trifosfato dATP desoxiadenosina trifosfato o trifosfato de desoxiadenosina dCTP Desoxicitidina trifosfato dGTP Desoxiguanosina trifosfato dTTP timidina trifosfato EMRQ Empresa Metropolitana de Rastro de Quito G+C Contenido de guanina mas citosina IgG Inmunoglobulina tipo G IFI Inmunofluorescencia indirecta kDa Kilodalton kpb kilopares de bases MAS muestreo aleatorio simple mM mili Molaridad MSPs Proteínas mayoritarias de superficie PCR Reacción en dadena de la polimerasa pb par de base spp especie U unidades % Porcentaje % I Porcentaje de inhibición °C Grados centígrados µm micrometro µM micro Molaridad